Mens høy oppløsning smelte analyse gir evnen til å differensiere mellom enkelt-nukleotid polymorfismer i en heterogen populasjon, kan mutant allel forsterkning forspenning øke dens evne til å påvise tilstedeværende alleler ved relativt lave prosentandeler i en prøve. Denne protokollen beskriver forbedringer som forbedrer følsomheten av høy oppløsning smelteanalyse.
Til tross for flere tiår med utrydding innsats, forblir malaria en global byrde. Nylige fornyet interesse for regional eliminering og global utrydding har vært ledsaget av økt genomisk informasjon om plasmodiumparasitten arter som er ansvarlige for malaria, inkludert egenskapene til geografiske populasjoner samt variasjoner forbundet med redusert følsomhet overfor anti-malaria medisiner.
En vanlig genetisk variasjon, single-nukleotid polymorfismer (SNPs), tilbyr attraktive mål for parasitten genotyping. Disse markørene er nyttig ikke bare for å spore narkotika resistensmarkører, men også for sporing parasitt populasjoner bruker markører som ikke er under narkotika eller andre selektive press.
SNP genotyping metodene tilbyr muligheten til å spore narkotika motstand samt å fingeravtrykk enkelte parasitter for overvåking befolkningen, spesielt i respons til malaria kontroll innsats i områder nærmer elimination status.
Mens informative SNPs har blitt identifisert som er agnostiker til bestemte genotyping teknologier, er høy oppløsning smelter (HRM) analyse spesielt egnet til felt-baserte studier. Sammenlignet med standard fluorescerende-probe baserte metoder som krever individuelle SNPs i en enkelt merket probe og tilbyr i beste fall 10% sensitivitet for å oppdage SNPs i prøver som inneholder flere genomer (polygenomic), HRM tilbyr 2-5% sensitivitet. Modifikasjoner til HRM, for eksempel blokkerte prober og asymmetriske primer konsentrasjoner, så vel som optimalisering av forsterkning annealing temperaturer for å forspenne mot PCR-amplifikasjon av det mindre allelet, ytterligere øke sensitiviteten av HRM. Mens følsomheten forbedring avhenger av den spesifikke analyse, har vi økt deteksjonsfølsomheter til mindre enn 1% av det mindre allel.
I regioner nærmer malaria utrydding, er avgjørende for pr tidlig påvisning av nye eller importert narkotika motstandompT respons. Likeledes, kan evnen til å oppdage polygenomic infeksjoner og differensiere importerte parasitt typer fra kryptiske lokale reservoarer informerer kontrollprogrammer.
Dette manuskriptet beskriver modifikasjoner høy oppløsning smelte teknologi som øker følsomheten for å identifisere polygenomic infeksjoner i pasientprøver.
Til tross for fornyet interesse for malaria kontroll og utrydding, forblir malaria en verdensomspennende byrde, med nesten halvparten av verdens befolkning står i fare for infeksjon og mer enn 550.000 dødsfall årlig, spesielt barn i Afrika sør for Sahara en.
Disse nye bekjempe og utrydde programmer har blitt støttet av genomisk renessanse, med et stort antall malariaparasitter sekvensert og analysert for mutasjoner assosiert med redusert narkotika følsomhet, økt virulens, og for befolknings egenskaper 2,3. Single-nukleotid polymorfismer (SNPs) er blant de hyppigst identifiserte genetiske varianter 4-7.
Bærbare SNP genotyping metodene tilbyr på stedet og real-time befolkningen overvåking og sporing 8. I tillegg til å fingerprinting individuelle parasitter, er den "molekylære strekkoden 'også brukes til å detektere dramatiske temporale endringer i frekvens allelsamt variansen effektiv populasjonsstørrelse og kompleksitet infeksjon 9.
Mens dette settet av informative SNPs enkelt tilpasses mange genotyping plattformer, høy oppløsning smelter (HRM) Analysen er spesielt godt egnet til feltbaserte studier, hvor sensitive og enkel betjening og påvisning av nye mutasjoner til lave kostnader i forhold til sekvensering og andre tilnærminger er attraktive i ressursfattige innstillinger.
HRM starter med standard polymerase kjedereaksjon (PCR) som inneholder et fluorescerende fargestoff. Post-PCR smelter analyse bestemmer peak amplicon smeltetemperatur; en enkelt SNP forskjell i en kort amplikon kan resultere i betydelig spiss-smelte-temperatur (Tm) forskjeller.
Flere forbedringer til denne metoden bedre genotyping vedtak om å skille SNPs inkludert klasse IV (AT) SNPs, og oppdage mindre mutante alleler i prøver med flere alleler stede (polygenomic infeksjoner). Først analysene innlemme korte prober sentrert over SNP-regionen i tillegg til forover og revers primere som er til stede ved forskjellige konsentrasjoner. Disse blokkerte prober ikke er forsterket ved PCR, men binder seg til strengen som produseres i overskudd på grunn av asymmetriske primer konsentrasjoner som øker produksjonen av sonde-mal produkt. Disse separate dobbelt-trådede amplikonene som består av probe bundet til det overskytende templatkjeden er ~ 20 til 30 bp; deres betydelig redusert lengde i forhold til hele amplikonet (80-150 bp) føre til mye større Tm forskjeller knyttet til én eller flere basis probe-malen ikke samsvarer med 10.
For det andre mutant allel forsterkning skjevhet (MAAB) senker reaksjonsglødetemperaturen for å forspenne reaksjonen mot mutante alleler til stede ved lave forhold i polygenomic infeksjoner. Glødetemperaturen ligger mellom de Tms med perfekt matchet (villtype) og feilaktige (mutant) probes. Ved denne temperaturen, binding av villtype-allelet er stabil nok til at amplifikasjon blir hindret i forhold til sin mismatch tilsvarende, og dermed forspenne forsterkning mot mutant allel når begge er til stede i en enkelt prøve 10.
Med disse HRM forbedringer, har denne teknologi tillot sporing av opprinnelse og identiteten av parasitter i forbindelse med epidemiske infeksjoner i Sør-Amerika 11 og påvisning av nye mutasjoner, differensiering av flere SNP som ligger umiddelbart ved siden av hverandre i sekvens, og mutasjoner til stede i mindre enn ett % av allelene i polygenomic prøvene 10.
Økt følsomhet er spesielt viktig i områdene nærmer pre-eliminering status og de med risiko for nye medikamentresistens. Evnen til å raskt og enkelt identifisere importerte parasitter og SNPs assosiert med redusert følsomhet på stedet opplyser overvåkingsarbeidet og kontrollprogrammer omeffektiviteten av sine implementeringer og identifiserer hotspots for økt malaria utrydding og eliminering innsats. Denne protokollen beskriver metoder for blokkert-probe-basert og MAAB for økt HRM genotyping følsomhet.
Kontinuerlig HRM er et post-PCR-analyse trinn; Derfor, er prøven og analyseoppsett lik standard PCR protokoller, med den ytterligere innlemmelse av et fluorescerende fargestoff interkalerende brukes til å følge overgangen fra dobbelt-trådet til enkelttrådet DNA i løpet av høyoppløselige smeltetrinn. Den viktigste faktoren for vellykket HRM analyse er en robust PCR produkt. Analysen design er nøkkelen, og flere verktøy optimalisert for HRM analysen designen er tilgjengelig kommersielt og online 13. Amplicon lengder på 80-150 basepar med tilhørende ~ 20 basepar blokkert sonder sentrert over SNP eller SNPs av interesse arbeid best å skille SNPs samt haplotyper av flere SNPs i sonden regionen. Prober kan bli blokkert ved hjelp av enten en 3 'C3 spacer eller en to basepar mistilpasning i 3'-enden, som hindrer forlengelse i løpet av amplifisering. Prober kan være utformet for å matche Watson eller Crick templatkjeden; Valgetavhenger empirisk testing for å avgjøre hvilken probe design gir akseptable smeltetopper. Overskytende fremover eller bakover primere blir brukt til å produsere enkelt-trådet amplifikasjonsprodukt som hybridiserer til de blokkerte sonder. Dersom proben inneholder den fremre trådsekvens, og deretter revers primer anvendes i overskudd, vanligvis i et 1: 5-forhold, og vice-versa for prober som svarer til den motsatte tråden.
Tilsvarende fungerer HRM best med tilstrekkelig og robust PCR produkt. PCR reaksjon optimalisering krever gradient PCR og agarosegeler eller Bioanalyzer analyse for å fastslå optimale annealing temperaturer. Mal-konsentrasjonen kan økes ved anvendelse av metoder så som forhåndsforsterkning, forspent multiplekset amplifikasjon av alle mål ved bruk av lavt primer konsentrasjon og syklus tall for å øke konsentrasjonen 13 av malen.
Bare en håndfull av instrumenter er kompatible med MAAB. De termiske egenskapene til glasskapillærer rør brukt in disse systemene lette denne metoden. Den lille indre diameter av kapillærene, samt rask varmeoverføring gjennom glass har strengere temperaturkontroll enn standard PCR plasticware, som har lavere overgangshastigheter mellom varmebehandlingssykluser og denaturering på grunn av de termiske isolerende egenskaper av plast. Med denne metoden kan deteksjonsfølsomheter reduseres fra 2-5% til mindre enn 1% av et mutant allel i en blanding av villtype og mutante alleler 10.
HRM er en lettvint, effektiv og økonomisk verktøy for SNP genotyping i en rekke innstillinger og en rekke bruksområder, fra infeksjonssykdom overvåking til scanning for kreft genvarianter. Flere andre instrumenter, som for eksempel Roche Nano og LightCycler systemer (480 og 96) samt Eco Real-time PCR system tilbudet HRM i tillegg til standard forsterkning, real-time, og copy-nummer funksjonalitet. Ved hjelp av høyere throughput maskiner, koster HRM barcoding less enn $ 0,50 per analysen i våre hender, inkludert alle reagenser og forbruksvarer.
I forbindelse som er beskrevet her, feltbaserte applikasjoner tillate sanntidsovervåkning populasjonen for endringer forbundet med malaria kontroll innsats, inkludert redusert populasjon mangfold påvisning av importerte parasitt typene, og utseendet og spredning av SNP'er assosiert med redusert medikamentsensitivitet. Forbedringer til metoden gir ekstra følsomhet nyttig for å informere fremgang mot malaria eliminering og utrydding.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Bill og Melinda Gates Foundation for sin støtte til teknologiutvikling og opplæring.
LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
TE | Teknova | T0226 | |
Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
PCR grade water | Teknova | W3330 | |
Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |