マウスの脳の側脳室における上衣繊毛のライブイメージング
Summary
高解像度の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を用いて、マウス脳室の中に位置運動上衣繊毛の鼓動のex vivo観察ライブイメージングによって実証されます。技術はユニークな繊毛運動の周波数の記録や暴行角度ならびにそれらの細胞内カルシウム振動ペーシング特性を可能にします。
Abstract
Multiciliated上衣細胞は、成人の脳内脳室を裏打ちします。上衣繊毛の異常機能または構造は、様々な神経障害と関連しています。運動性上衣繊毛技術の現在のex vivoでのライブイメージングは、いくつかの手順に従って、毛様体のダイナミクスの詳細な研究を可能にします。これらの手順は次のとおりです。マウス二酸化炭素で安楽死をトレドの施設内動物管理使用委員会（IACUC）の大学のプロトコルに従って、頭蓋骨切除術は、脳の除去と上衣繊毛を可視化することができる脳側脳室を介して、非常に薄い部分を得るためにビブラトームまたは鋭利な刃で矢状脳解剖を行いました。 95％/ 5％Oの存在下で、2 / CO 2混合物を37℃でのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/高グルコースを含むカスタマイズされたガラス底プレート中の脳のスライスのインキュベーションは、生きた組織を維持するために不可欠です間に実験。繊毛の鼓動のビデオは、高解像度の微分干渉顕微鏡を用いて記録されています。ビデオは、次に、繊毛拍動頻度を計算するために、フレーム毎に解析されます。これは彼らの繊毛運動の周波数と角度に基づいて三つのカテゴリーやタイプに上衣細胞の明確な分類を可能にします。さらに、この技術は、上衣細胞の固有の細胞内カルシウム振動特性ならびにカルシウム振動における薬剤の効果および繊毛拍動頻度を特徴付ける高速蛍光イメージング分析の使用を可能にします。また、この技術は、毛様体及び毛様体構造タンパク質の局在化研究のための免疫蛍光イメージングに適しています。これは、疾患の診断および表現型の研究において特に重要です。脳組織が死ぬことを始めると技術の主な制限は、ライブ運動性繊毛運動の減少に起因します。
Introduction
繊毛は、細胞外環境に細胞表面から延びる感覚微小管ベースの細胞小器官です。 「9 + 0」または「9 + 2 " – それらの微小管の組織に応じて、繊毛は、2つのタイプに分類することができます。機能的には、それらの運動性に基づいて、これらの運動性または非運動性繊毛1のように分類することができます。一次繊毛は、一般に「9 + 0 "非運動性繊毛を示すために使用される用語です。これらは（「9」によって示される）9平行二重微小管を有し、微小管の中心対は（ '0'で示される）中心シース内に存在しません。しかし、胚の左右差を調節するような結節繊毛のようないくつかの「9 + 0」の繊毛は、2運動性です。一方、運動性繊毛は、微小管のダブレットの追加の中央対によって、9平行微小管のダブレットに加えて、特徴とし、運動性を容易にするために、ダイニンモータータンパク質に関連します。また、いくつかの「92」は、嗅覚繊毛のような繊毛は3非運動性です。脳室および脊髄の中心管の内側を覆う上衣細胞は、脳室4に沿って脳脊髄液（CSF）を推進運動性繊毛によって特徴付けられます。
この方法の全体的な目標は、運動性繊毛のダイナミクスと構造異常を研究促進することです。脳の健康と開発は多額の脳室内のCSFの効率的な循環に依存します。例えば、正常なCSFの流れおよび流体バランスは正常な鼓動ひいては神経細胞の指向性移動の調節に重要な役割を果たし、細胞遊走7幹機能上衣繊毛5,6を必要とします。このような、異常な上衣繊毛機能や構造などの水頭症に関連付けられている異常なCSFの流れにおいて、a、bの心室におけるCSFの異常な蓄積がある医学的状態につながることができます雨。この結果、頭蓋内圧亢進とヘッドの進行性肥大、痙攣、トンネルビジョン、精神障害8を引き起こす可能性があります。
独自の繊毛拍動頻度と叩解角度に基づいて、I、II、およびIII：既存の方法に対するこの手法の利点は、三つの異なる上衣細胞タイプを報告する最初の時間に許可することです。これらの上衣細胞は、脳室内の特定の領域内に局在しています。また、年齢や、上衣細胞型またはそれらのローカライズを変更することで、アルコールおよびシロスタゾールなどの薬理学的薬剤の効果は、上衣細胞のこの分類の前には不可能であった、実証することができます。シロスタゾールは、ホスホジエステラーゼ3の阻害剤、cAMPのAMPへの代謝酵素であり、それはまた、細胞内カルシウムを調節する9。高速蛍光画像分析を使用して、ユニークな細胞内のイメージングおよび定量化を可能にします上衣細胞のカルシウム振動特性。例えば、アルコールおよびシロスタゾールの両方が大幅に順番に、上衣繊毛10による脳脊髄液の体積交換の変化につながる可能性上衣繊毛運動の周波数だけでなく、細胞内のカルシウム振動特性を変化させました。要約すると、この手法は、異なるカルシウム振動特性を有する上衣細胞の三つの異なる種類の最初の証拠を提供するための鍵でした。
次のセクションでは、手順の詳細なステップバイステップの概要は、組織調製および取り扱いに細心の注意を払って、提供されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ライブイメージングおよび脳室上衣内繊毛の迅速かつ高感度近接観察を提供し、蛍光顕微鏡の両方のマウス脳組織の調製のためのプロトコールは、ここで説明します。この技術は、側脳室のみに限定されません。それは、他の脳室に繊毛を観察するために利用することができます。このイメージング技術は、ex vivo環境で繊毛運動によってCSFの動きに似ているライブストリームを提供し…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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