Samtidig<em> Ex vivo</em> Funktionstest av två näthinnor efter<em> In vivo</em> Elektroretinogram System
Summary
Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.
Abstract
An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.
Introduction
Elektroretinogram (ERG) är en väletablerad teknik som kan användas för att registrera den elektriska aktiviteten i näthinnan utlöses av ljus. ERG signal genereras huvudsakligen av spänningsändringar orsakade av radiella strömmar (längs axeln av fotoreceptorer och bipolära celler) som flyter i det resistiva extracellulära utrymmet av näthinnan. Den första ERG signalen spelades in 1865 av Holmgren från ytan av ett fisköga 1. Einthoven och Jolly 1908 2 dividerat ERG svar på uppkomsten av ljus i tre olika vågor, kallade a-, b-, och c-vågor, som nu är kända för att reflektera huvudsakligen aktiviteten av fotoreceptorer, ON bipolära celler, och pigmentepitel celler, respektive 3-8. ERG kan spelas in från ögonen på sövda djur eller människor (in vivo), från isolerade ögonpreparat 9, över isolerad intakt näthinnan (ex vivo) 3,10-15 eller över specifika näthinnan skikt med mikroelektroder (lokalERG) 4,16. Av dessa är in vivo-ERG för närvarande den mest använda metoden för att bedöma näthinnefunktion. Det är en icke-invasiv teknik som kan användas för diagnostiska ändamål eller för att följa framskridandet av retinala sjukdomar hos djur eller patienter. Men in vivo ERG inspelningar producera en komplicerad signal med flera överlappande komponenter, ofta förorenade av extraocular fysiologiska buller (t.ex. andning och hjärtverksamhet).
Lokal ERG kan användas för att spela in signalen över specifika skikt i näthinnan, men det är den mest invasiva och har den lägsta signal-till-brusförhållandet (SNR) jämfört med de andra ERG inspelningskonfigurationer. Lokal ERG är också tekniskt krävande och kräver dyr utrustning (t.ex. mikroskop och mikromanipulatorer). Transretinal ERG från den intakta, isolerade näthinnan (ex vivo ERG) erbjuder en kompromiss mellan in vivo och lokala ERG metoder möjliggör en stabil och high SNR inspelningar från intakta näthinnor av djur eller människor 17. På senare tid har denna metod använts framgångsrikt för att studera tappar och stavar ljusmätare funktion i däggdjurs, primat och mänskliga näthinnor 18-20. På grund av bristande pigmentepitel i ex vivo näthinnan, den positiva c-vågkomponent av ERG signalen bort och en framstående negativ långsam PIII komponent avslöjas i ex vivo inspelningar. Den långsamma PIII komponent har visat sig härröra från aktiviteten hos Müller gliaceller i näthinnan 21-23. Sålunda kunde ex vivo ERG metoden också användas för att studera Muller-celler i intakt näthinna. Flera studier har också visat att ex vivo ERG inspelningar kan användas för att mäta koncentrationen av farmakologiska medel runt näthinnan 24 och testa säkerheten och effekten av droger 25-27.
Flera kommersiella in vivo system finns ochanvänds i många laboratorier som inte nödvändigtvis har omfattande elektro bakgrund. Däremot har ex vivo-enheter inte varit tillgänglig förrän nyligen 17 och som ett resultat endast ett fåtal laboratorier för närvarande drar nytta av denna kraftfulla teknik. Det skulle vara fördelaktigt att göra ex vivo ERG inspelningar tillgängliga för fler laboratorier i syfte att förbättra vår kunskap om retinal fysiologi och patologi, och att utveckla nya terapier för bländande sjukdomar. Vi visar här en enkel och prisvärd ex vivo ERG anordningen 17 och visar hur den kan användas i kombination med flera kommersiellt tillgängliga in vivo ERG-system för att spela in stång- och kon-förmedlad signalering (A- och B-vågor) och funktionen hos Müller-celler (långsam PIII) från intakta vildtyp mus näthinnor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visar här de kritiska stegen för att erhålla högkvalitativa ex vivo ERG inspelningar samtidigt från två isolerade mus näthinnor genom att använda in vivo ERG systemkomponenter tillsammans med en ex vivo ERG adapter. I denna studie perfunderades vi båda näthinnor från djuret med samma lösning (antingen Ames ', Lockes eller Ringers) men det är även möjligt att BEGJUTA varje näthinna med en annan lösning, t.ex., för läkemedelsteständamål. De viktigaste s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH bidrag EY019312 och EY021126 (VJK), EY002687 till Ögonkliniken och Visual Sciences vid Washington University, och forskning för att förebygga blindhet.
Materials
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
