समकालिक<em> पूर्व vivo</emदो Retinas की> कार्यात्मक परीक्षण से<em> Vivo</em> Electroretinogram सिस्टम
Summary
Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.
Abstract
An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.
Introduction
Electroretinogram (एर्ग) प्रकाश से चालू होने वाले रेटिना की विद्युतीय गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। एर्ग संकेत रेटिना की प्रतिरोधक बाह्य अंतरिक्ष में बह रेडियल धाराओं की वजह से वोल्टेज परिवर्तन (फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं की धुरी के साथ) द्वारा मुख्य रूप से उत्पन्न होता है। पहले एर्ग संकेत एक मछली की आँख 1 की सतह से Holmgren द्वारा 1865 में दर्ज की गई थी। Einthoven और जॉली 1908 2 बी, ए कहा जाता है तीन अलग अलग तरंगों में रोशनी की शुरुआत के लिए एर्ग प्रतिक्रिया, और सी-तरंगों, अब द्विध्रुवी कोशिकाओं, photoreceptors के मुख्य रूप से गतिविधि प्रतिबिंबित करने के लिए जाना जाता है, और वर्णक उपकला विभाजित सेल, क्रमशः 3-8। एर्ग स्थानीय (microelectrodes के साथ (पूर्व vivo) पृथक बरकरार रेटिना के पार, पृथक आंख तैयारी 9 से, anesthetized जानवरों या (vivo में) मनुष्यों की आंखों से 3,10-15 या भर में विशिष्ट रेटिना परतों दर्ज किया जा सकताएर्ग) 4,16। इनमें से इन विवो एर्ग वर्तमान में रेटिना समारोह का आकलन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। यह नैदानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या जानवर या रोगियों में रेटिना रोगों की प्रगति का पालन करने के लिए है कि एक noninvasive तकनीक है। हालांकि, इन विवो एर्ग रिकॉर्डिंग अक्सर दृष्टितर शारीरिक शोर (जैसे, श्वास और हृदय की गतिविधि) से दूषित, कई अतिव्यापी घटकों के साथ एक जटिल संकेत उत्पादन।
स्थानीय एर्ग रेटिना के विशिष्ट परतों में संकेत रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन यह सबसे आक्रामक है और अन्य एर्ग रिकॉर्डिंग विन्यास की तुलना में सबसे कम संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) है। स्थानीय एर्ग भी तकनीकी रूप से मांग कर रहा है और महंगे उपकरण (जैसे, माइक्रोस्कोप और micromanipulators) की आवश्यकता है। अक्षत, पृथक रेटिना से Transretinal एर्ग (पूर्व vivo एर्ग) स्थिर और hig की इजाजत देने में विवो और स्थानीय एर्ग तरीकों के बीच एक समझौता प्रदान करता हैजानवरों या इंसानों 17 के बरकरार रेटिना से ज SNR की रिकॉर्डिंग। हाल ही में, इस विधि, स्तनधारी रहनुमा और मानव retinas के 18-20 में रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर समारोह का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, के कारण पूर्व vivo रेटिना में वर्णक उपकला के अभाव के एर्ग संकेत के सकारात्मक सी लहर घटक निकाल दिया जाता है और एक प्रमुख नकारात्मक धीमी PIII घटक पूर्व vivo रिकॉर्डिंग में पता चला है। धीमी गति से PIII घटक रेटिना 21-23 में मुलर glia कोशिकाओं की गतिविधि से ही शुरू करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, पूर्व vivo एर्ग विधि भी बरकरार रेटिना में मुलर कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कई अध्ययनों से यह भी कहा कि पूर्व vivo एर्ग रिकॉर्डिंग रेटिना 24 के आसपास औषधीय एजेंटों की एकाग्रता को मापने और दवाओं 25-27 की सुरक्षा और प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पता चला है।
विवो सिस्टम में कई वाणिज्यिक उपलब्ध हैं औरजरूरी व्यापक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पृष्ठभूमि नहीं है कि कई प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है। इसके विपरीत, पूर्व vivo उपकरणों हाल ही में 17 तक और केवल बहुत कुछ प्रयोगशालाओं वर्तमान में इस शक्तिशाली तकनीक का लाभ उठा रहे हैं एक परिणाम के रूप में उपलब्ध नहीं है। यह रेटिना शरीर विज्ञान और विकृति के बारे में हमारे ज्ञान अग्रिम, और रोगों चकाचौंध के लिए नए उपचारों के विकास के लिए और अधिक प्रयोगशालाओं के लिए पूर्व vivo एर्ग रिकॉर्डिंग उपलब्ध बनाने के लिए लाभकारी होगा। हम यहाँ एक सरल और सस्ती पूर्व vivo एर्ग डिवाइस 17 प्रदर्शित करता है और यह rod- और शंकु की मध्यस्थता संकेतन रिकॉर्ड करने के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इन विवो एर्ग सिस्टम के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे शो (ए और बी-तरंगों) और समारोह के बरकरार जंगली प्रकार माउस रेटिना से मुलर कोशिकाओं (PIII धीमा)।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ एक पूर्व vivo एर्ग एडाप्टर के साथ मिलकर इन विवो एर्ग प्रणाली घटकों का उपयोग करके दो पृथक माउस रेटिना से एक साथ उच्च गुणवत्ता वाले पूर्व vivo एर्ग रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच अनुदान EY019312 और EY021126 (VJK), वाशिंगटन विश्वविद्यालय में नेत्र विज्ञान विभाग और दृश्य विज्ञान के लिए EY002687 द्वारा समर्थित किया गया था, और अनुसंधान के द्वारा अंधापन रोकने के लिए।
Materials
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
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