Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

بروتوكول الحليمات دنفر للتحليل الموضوعي لكمئي الحليمات

Published: June 8, 2015 doi: 10.3791/52860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Health Sciences Department, Denver Museum of Nature & Science, 2Department of Mathematical and Statistical Sciences, University of Colorado Denver

Summary

نحن هنا نقدم بروتوكول لقياس كثافة كمئي حليمة من الصور الرقمية. هذا الأسلوب يعتمد تحديد الأولويات والمقاييس مميزة الموضوعية في عمل وصفي الأصلي على كمئي الحليمات التي كتبها ميلر وريدي (1990).

Abstract

الهدف من البروتوكول الحليمات دنفر هو استخدام مفتاح بين شيئين لتعريف وتحديد أولويات خصائص كمئي الحليمات (FP) لضمان تسجيل متناسقة بين الهدافين. هذا البروتوكول يبني الخروج من الحاجة التي نشأت من خلال العقدين الأخيرين من البحوث طعم باستخدام FP كوكيل لكثافة طعم المسام. تاريخيا تم تحليل كثافة FP باستخدام ميلر وريدي عام 1990 الأوصاف من التشكل: جولة، ملطخة أخف وزنا، بوجه عام، ومرتفعة. في هذا العمل، محذر المؤلفون أن تعريفات أكثر صرامة من FP التشكل اللازمة لتكون الخطوط العريضة. على الرغم من هذا دعوة إلى العمل، وقد تم متابعة الأدب نادرة، ومعظم الدراسات المستمرة في الاستشهاد ميلر وريدي في العمل الأصلي. ونتيجة لذلك، كانت تقارير كثافة FP متغير بدرجة كبيرة و، جنبا إلى جنب مع أحجام عينة صغيرة، يمكن أن تسهم في استنتاجات متباينة حول دور FP في حساسية الذوق. في علم الوراثة من طعم مختبر استكشاف هذه incon واضحsistency في العد وجدت أن الهدافين تم إعطاء الأولوية بشكل فردي على أهمية هذه الخصائص بشكل مختلف وليس لديه توجيهات لأنه عندما كان حليمة بعض، ولكن ليس كل شيء، من الصفات المبلغ عنها FP. ونتيجة لهذا الذاتية هي التهم FP شديدة التباين من نفس الصورة اللسان. وقد تم تطوير بروتوكول الحليمات دنفر الى تدارك هذه النتيجة من خلال استخدام مفتاح شيئين أن المزيد من يعرف وأولوياتها أهمية الخصائص التي وضعتها ميلر وريدي. الطريقة المقترحة يمكن أن تساعد في خلق وسيلة معيارية لقياس FP للباحثين في مجال الذوق والدراسات في مجال التغذية.

Introduction

الحليمات هي المطبات مرئية على سطح اللسان. هناك أربعة أنواع من الحليمات: كمئي (FP)، تورق، محوط، وخيطية الشكل. بينما تنتشر الحليمات خيطية الشكل على سطح اللسان، ويتم ترجمة محوط فقط على الجزء الخلفي من اللسان، وتوجد تورق على الجانبين. في المقابل، FP تقع نحو الجزء الأمامي من اللسان. تعتبر FP، تورق، والحليمات الكأسية الذوقية لأن لديهم القدرة على احتواء براعم الذوق في حين خيطية الشكل لا. براعم الذوق هي مجموعات من الخلايا المسؤولة عن كشف tastants الكيميائية وtransducing المحفزات إلى إشارة الذوقية في الدماغ. اللعاب والطعام جزيئات تدخل في براعم الذوق من خلال فتحات تسمى المسامات طعم حيث ثم يكون جزيئات طعم إمكانات تفعيل الخلايا الذوقية.

ومن المثير للاهتمام، وهناك فروق فردية كبيرة في كثافة براعم التذوق، كما لوحظ لأول مرة في دراسة النسيجية الألسنمن 18 جثة (ميلر، 1988) 1. براعم الذوق نفسها لم تكن مرئية على سطح اللسان، ومع ذلك، المسام طعم مرئية عند استخدام تقنيات التكبير، والإضاءة، وتلطيخ المناسبة مما أدى ميلر وريدي (1990) لتطوير وسيلة لتحديد المسام الذوق وكمئي الحليمات باستخدام videomicroscopy في المعيشة البشر 2. هناك عدد من المعامل قد عدلت تقنية videomicroscopy الأصلية، وذلك باستخدام التصوير الثابتة وضئيلة أو معدومة التكبير. ومع ذلك، منذ كمئي الحليمات هي أسهل بكثير لتصور من هم المسام باستخدام هذه التقنيات الأخيرة، تحولت مختبرات لعد كمئي الحليمات في مكان المسام الذوق. في القيام بذلك، فمن المفترض أن كثافة كمئي حليمة هي مقياس الوكيل معقول لكثافة طعم المسام، على الرغم من العديد من كمئي الحليمات لا تحتوي على مسام طعم أو براعم الذوق 3؛ ليس فقط هي FP أكثر وضوحا ويمكن الوصول إليها من محوط وتورق الحليمات، ولكن التقاط الصور الخاصة بهم هو أقل منظمة الشفافية الدوليةلي المستهلكة من تحليل طعم المسام من خلال طريقة بديلة لvideomicroscopy 2،4. في عام 1990، ميلر وريدي تستخدم هذه التقنية لتجد أن طعم وترتبط كثافة المسام ذات الكثافة FP 3 وهو الأمر الذي أكدته أيضا في بارتوشوكا وآخرون. 5 وبالإضافة إلى هذه العلاقة التشريحية، كما وجدت ميلر والريدي أن 8 أشخاص في الجزء العلوي نصف طعم توزيع كثافة المسام أيضا تصنيف السكروز، كلوريد الصوديوم، وبروبيل ثيوراسيل (دعامة) كما ملحوظ أكثر كثافة من فعل 8 أشخاص آخرين 3. لاحظ عمل لاحق من بارتوشوكا وآخرون (1994) وجود علاقة بين suprathreshold كثافة طعم PROP وكثافة كمئي حليمة، فضلا عن كثافة طعم المسام، في 42 موضوعات 5. أدت هذه الطريقة مريحة للدراسات مؤثرة التقارير أن الأشخاص الذين لديهم العديد من الحليمات ألسنة تثير رد فعل أقوى للعديد من tastants، بما في ذلك tastants فينيل ثيوكرباميد المر (PTC) ودعامة 6،7.

المؤسسة العامة للاتصالات وPROP هي tastants مدروسة جيدا تستخدم كثيرا نظرا لارتباط واضح بين حساسية الذوق النمط الظاهري الشخص وراثى الخاصة بهم. وقد أظهرت الدراسات السكانية أن الناس الذين لديهم diplotype المتنحية متماثل من الجين، TAS2R38، لديها حساسية أقل بكثير لدعم من حاملي البديل مهيمن أو متخالف من الجين 10/08. وذكرت هذه الظاهرة وراثية لأول مرة في 1932 عندما أعلن آرثر L. فوكس اكتشافه من "العمى طعم" لPTC 11. بين الناس قادرة على تذوق هذه المركبات المريرة، ذكرت وشدة الطعم يمكن أن تختلف في أي مكان من غير سارة قليلا إلى المرير لايطاق 6. لحساب التباين التي لا يمكن تفسيرها من خلال TAS2R38، وضعت نظرية عليها أنه يمكن أن يعزى إلى كثافة FP على اللسان 4.

ومع تقدم الأبحاث الذوق، وFIELتم تقسيم د في مدرستين في التفكير حول هذه النظرية فيما يتعلق بدور FP وحساسية الطعم المر. على الرغم من أن العديد من الدراسات هذا الزعم الأصلية التي الكثافة FP عاملا في PROP الحساسيات 4،6،12،13، كان هناك طوارئ صغير، ولكن المهم أن لديها ادلة لدحضها، وتقديم التقارير عدم القدرة على تكرار الدور 10، 14،15،16. Delwiche وآخرون. (2001) حذر من أن الاتجاه هو متغير بدرجة كبيرة. كثافة FP يفعل الاعتبار ليس موحد للاختلافات في الحساسية المرارة عبر الموضوعات، وكان يمكن إثباتها فقط بالنسبة للاشخاص الذين لا يقل حساسية معتدلة لدعم 7. بالإضافة إلى استخدام تعريف أقل صرامة ميلر وريدي طريقة حول كيفية تحديد FP، فمن المهم أن نلاحظ أنه مع استثناء من نسل سد قندس الدراسات 15 أجرته فيشر وآخرون، فإن معظم الدراسات السابقة كان عينة صغيرة الأحجام التي قد تسهم أيضا في النتائج غير متناسقة علىدور FP في الذوق.

لفترة وجيزة، في ميلر وريدي في ورقة منهجية المنوية (1990)، والكتاب الملون ألسنة الزرقاء لتحديد FP بسبب FP تبقى الوردي أثناء الحليمات خيطية الشكل تمتص الصبغة وبدوره الزرقاء. أنها تصنف FP بأنها "هياكل الوردي مدورة حوالي 0.5 ملم في القطر" 2. في حين نصحت الكتاب أنه قبل استخدام هذا الأسلوب لمزيد من العمل التحليلي، وخصائص FP يجب أن تكون محددة بشكل صارم وخلصت إلى أن الاختلاف أشار بالفعل في الأدب "قد تنسب إلى مجموعات سكانية مختلفة الموضوع، وأساليب مختلفة، والمحققين مختلفة" 2، على وقد أدى البحث إلى خصائص المقبولة عموما أن FP هي الجولة 17،18، كبير 2، الوردي أو ملطخة أخف وزنا 2، و ارتق 4. تؤخذ على علاتها، ويبدو أن هذه الخصائص مباشرة جدا الى الامام. في علم الوراثة من طعم مختبر (معمل أو مختبر حصلت)، واستخدام والتقىتم هود تعقيدا بسبب المحاولات الفردية الهدافين 'في التصفيات وإعطاء الأولوية لأهمية الخصائص المذكورة أعلاه عند بعض، ولكن ليس كل شيء، من خصائص كانت موجودة. وتشمل هذه المضاعفات الحليمات الصغيرة التي ظهرت الوردي في خضم الحليمات أكبر من ذلك بكثير. اللسان كامل امتصاص الصبغة الزرقاء وبالتالي القضاء على التصنيف على أساس اختلاف اللون. الحليمات مستطيل بدلا من الجولة. والألسنة عدم وجود اختلاف في الارتفاع، ساهمت جميعها لالهدافين الإبلاغ عن التهم FP على نطاق واسع متنوعة من نفس الصورة.

وأدت هذه الاختلافات في التحليل أن يراجعوا الأدب من أجل تحديد ذاتية، وتحديد أي استثناءات لخصائص FP المقبولة عموما، وفي نهاية المطاف وضع بروتوكول لبدقة وموضوعية تحديد وتسجيل FP.

أولا، يتم وصف شكل FP في الأدب باعتباره مدورة، مثل الفطر هيكل 17،18. ومع ذلك، أبرز ما عداوأشير أيضا إلى أيونات. وأكد ميلر أن مصطلح "كمئي" هي تسمية خاطئة وأن العديد من FP لا تتشكل فطر، ولكن يمكن أن تختلف على نطاق واسع في حجم ومورفولوجية 18. ميليس وآخرون. (2013) كما وصفت العديد من الحليمات التي كانت تعتبر "مشوهة"، حيث كان قطر FP في اتجاه واحد اثنين على الأقل من الانحرافات المعيارية أطول مما كانت عليه في اتجاه آخر 19. وعلاوة على ذلك، تشنغ وروبنسون وجدت أنه عندما تشير FP قبل التلوين، فقد تراوحت من شقة وتصدرت لممدود في المظهر 20. مشيرا إلى الاستثناءات المذكورة أعلاه، وتوصيف وFP يجري جولة ويظهر على شكل فطر أيضا تضييق تعريف.

الثانية، وصفت FP لون "الدوائر وردي على خلفية زرقاء" 7 بعد تلطيخ اللسان مع صبغة زرقاء. على الرغم من تلطيخ أخف وزنا وكان المعيار الأكثر ثباتا من FP طوال الأدب انه لم تصفيات موحدة. تشنغ & ؛ لاحظ روبنسون أن FP لم تكن دائما ملطخة طفيفة، مما يجعل من الصعب تحديد وغير مؤكد 20. يبدو إذن أن ألسنة امتصاص الصبغة بشكل مختلف وعلى الرغم من تباين واضح في العديد من اللغات، وأصبحت بعض الأزرق تماما دون أي تمييز حين أن البعض الآخر يفقد فورا عن أي أثر للصبغة زرقاء 21.

السمة الثالثة، وحجم FP، يتفق إلى حد ما بين أوراق، تتراوح ما بين 0.5 مم إلى 0.97 مم 6،18. في الأدب وأشار ميلر إلى أن هناك نطاقات حجم اثنين من الحليمات على الأمامي الظهري للسان. كان الحليمات بأقطار أكبر في المقام الأول كمئي والحليمات المخروطية، بينما كان الحليمات التي يبلغ قطرها أصغر معظمهم خيطية الشكل 18. ومع ذلك، مع استثناء من نسل سد قندس دراسة 21، وحجم لم تظهر لتحديد ما إذا كان هيكل هو FP في الأدب، ولكن لم تقدم للالحليمات تصنيفها بالفعل بأنه "كمئي".

_content "> وأخيرا، يتم سرد الارتفاع كما FP الرابع مميزة 4 على الرغم أشار ميلر إلى أن التمييز بين خيطية الشكل وكمئي الحليمات من الصعب عند استخدام هذه المعايير بالقرب من هامش اللسان. وأعطى مثالين من FP التي تختلف كثيرا في الارتفاع، واحد يجري 0.8 مم في الارتفاع في حين كان آخر أقل من 0.1 ملم في الطول، ولكن لا تزال لديها اثنين من المسام الذوق التي لوحظت بشكل واضح (18). وأعقب هذه الملاحظة أيضا، وأكد من قبل Shahbake وآخرون. 4

هذه التعريفات والاستثناءات التي أبلغت عنها تبين أن حقل طعم وقد اعترف منذ وقت طويل التناقض في وصف FP وأوجه القصور في بروتوكول شائعة الاستخدام من ميلر وريدي. في الواقع، ميلر وريدي حض مجال لزيادة تحديد ملامح FP 2. افترضنا أن الهدافين تم إعطاء وزن مختلف لخصائص وإعطاء الأولوية أهميتها بشكل مختلف عند حلمة الثديفشل illae لتلبية كل معيار، كما هو الحال عندما كانت حليمة كبيرة وفطر على شكل، ولكن الملون الأزرق. كان منطقيا أن المحققين من الدراسات التي نشرت سابقا المرجح فعل الشيء نفسه والتي تشكل مجتمعة مع أحجام عينة صغيرة، قد تكون مسؤولة عن نتائج متنوعة قادمة من استخدام هذا الأسلوب.

تناول مختبر حصلت هذه الفجوة في منهجية FP من خلال تطوير التوجيهي الذي يعرف كل سمة باستخدام قياسات موضوعية وتعطي الأولوية للخصائص التي تشير إلى الأسبقية في التحليل. هذا الأسلوب هو بروتوكول دنفر الحليمات (DPP)، مفتاح شيئين مع خصائص واضحة ومتميزة من FP لضمان التهم دقيقة وقابلة للتكرار من الصور الرقمية من اللسان. النيابة العامة هو الطريقة المقترحة لتوحيد المستخدمة سابقا ميلر وريدي الأسلوب، وبالتالي إزالة التفسير الفردي وضمان تحقيق نتائج أكثر اتساقا عند تحليل كثافة FP. من خلال القيام بذلك، DPP يمكن استخدامها لأكثر ثقة دetermine دور FP في الذوق.

وقد تم تحليل الصور اللسان اتخذت من الموضوعات من قبل العلماء المواطن (الهدافين) من مختبر الذين الموضوعات الحقيقية لهذه الدراسة. وتتألف لاب الأساسية من العلماء مواطن من أعضاء من المجتمع تتراوح أعمارهم (سنة) في الفترة من 16 وحتى منتصف 80S. ويصف تقرير تقييم تلخيصي بتكليف من متحف في عام 2012 العلماء المواطن على أن لها مصلحة قوية في مجال العلوم ومع الثلثين بعد أن حصل على شهادة جامعية في تخصص علمي (22). يتم تجنيد العلماء مواطن مرشح حاليا عن طريق الكلمة من فمه، يجب بنجاح إكمال عملية مقابلة مع المتطوعين المخضرم في المتحف، والخضوع لفترة اختبار في معرض الصحة الدائم للمتحف، إكسبيديشن الصحة، قبل أن تتاح لهم الفرصة لتقديم طلب للحصول على وظيفة في مختبر. مرة واحدة مقبولة في المختبر، يخضع العلماء المواطن التدريب لمدة 12 أسبوعا لتصبح معتمدة على الانخراط موضوع الإنسانالصورة. وبعد هذه الشهادة، وهم قادرون على اتخاذ وحدات تدريبية على تقنيات مختلفة في مختبر (على سبيل المثال العد الحلمية، استخراج DNA) وبعد شهادات إضافية وتدابير مراقبة الجودة العادية، هؤلاء العلماء المواطن لديهم الفرصة للمشاركة بنشاط في تحليل البيانات. العلماء المواطن بوقتهم ولا تعويض عن مساهماتها في المتحف.

Protocol

وقد تم جمع الصور سجل في هذه الدراسة كجزء من دراسة أكبر طعم أجريت في علم الوراثة من طعم مختبر في متحف دنفر الطبيعة والعلوم (متحف) 10. وكانت عينة الدراسة بشكل اكبر زوار المتحف (ن = 1195) تتراوح أعمارهم 18-93. في حين جاءت المواد من ستة من القارات السبع، وكان المشاركون في المقام الأول من أصل أوروبي. وقد تم جمع البيانات في كل موضوع في دورة واحدة مختبر 30 دقيقة. وافقت لجنة المراجعة المؤسساتية الغربية البروتوكول، أعطيت موافقة خطية مطلعة، والموضوعات تطوعت وقتهم ولم تعوض مشاركتهم في الدراسة.

1. جمع البيانات

  1. التقاط الصور
    1. مشاهدة تخضع صورة لكيفية تشكل نفسها (الشكل 1)، وما سوف الصورة التي تم التقاطها تبدو.
      الشكل 1 الشكل 1: التقاط الصور بوز.
    2. موضوعات المباشرة لتجف لغتهم مع منشفة ورقية جهة، وترك اللسان جاحظ من أفواههم.
    3. تطبيق حوالي 3 مل من الصبغة الزرقاء الطعام بتركيز 01:36 لقمة اللسان باستخدام معقم والحرير الصناعي قضيب مع طرف 1 بوصة. لدينا مواضيع يعود اللسان على أفواههم وابتلاع لإزالة الصبغة الزائدة.
    4. لدينا موضوعات تشكل نفسها كما هو مبين في الشكل رقم 1، مع الذقن على أيديهم والمرفقين مسنود على طاولة للاستقرار. موضوعات المباشرة لتوسيع سانهم مسافة مريحة وآمنة برفق بين أسنانهم.
    5. تلتزم 2.5 سم قطعة من ورق الترشيح مع 10 مم انقطاع دائرية لكمات في ذلك إلى طرف الأمامي من الجانب الأيسر من اللسان بالقرب من خط الوسط (انظر الشكل 1).
    6. تأخذ على الأقل ثلاثة صور عن قرب لسان، CApturing كامل 10 ملم انقطاع دائرية لضمان التصور جميع FP في هذا المجال. استخدام الإعداد الكلي للالرقمية نقطة واطلاق النار كاميرا عالية الجودة التي تعلق على حامل ثلاثي الأرجل لتحقيق الاستقرار.
      1. تكبير إلى الحد الذي يتم تصويره انقطاع كامل في حين لا يزال داخل أوصى نطاق التكبير الكاميرا. تأكد من أن الطائرة من عدسة الكاميرا هي موازية لطائرة من اللسان وأن انقطاع يبدو التعميم في الصورة بدلا من مستطيل. استعراض الصور للتأكد من أنها هي ذات جودة عالية ومفيدة لحساب.
  2. صورة اختيار وإعداد
    1. تحميل الصور إلى جهاز الكمبيوتر.
    2. من الصور التي التقطت لسان نفس الموضوع، واختيار واحد فقط لمزيد من التحليل بناء على تعريف واضح بين الهياكل على اللسان على أعلى التكبير وأقل زاوية مشوهة هكذا اللسان واسع وثابت نحو الكاميرا.
    3. فتح الصورة الخام المحدد في المصدر المفتوح حتىftware، يماغيج. انقر على "الإضافات" و في التمرير القائمة المنسدلة على "تحليل" وانقر على "مكافحة الخلية." عند فتح العداد الخلية، انقر فوق "تهيئة" لتصل الصورة إلى العداد الخلية.
      ملاحظة: وهنا، استخدم يماغيج 1.45 ثانية مع 32 بت جافا 1.6.0_10 الإصدار.
      1. استخدام التكبير القياسية من 50٪ من أجل التناسق بين الهدافين وللاستخدام في الخطوات اللاحقة ليسجل FP. نقل هذه الصورة إلى الجانب الأيسر من الشاشة بجانب العداد الخلية. وسوف تحال هذه الصورة على أنها نسخ (انظر الشكل 2، الجانب الأيسر من الشاشة).
  3. فتح نسخة ثانية من الصورة الخام (نسخة B) لقياس أقطار الحليمات يجري كميا. تكبير والتصغير حسب الحاجة لتفضيل هداف الفردي في جميع مراحل عملية التهديف. نقل هذه النسخة إلى الجانب الأيمن من الشاشة حتى النسختين ليست مشوشة عن طريق الخطأ. (انظر الشكل 2، يمينالشاشة)
  4. انقر على أداة الخط. باستخدام نسخة B، تكبير بقدر الضرورة لرسم بدقة قطر عبر الدائرة المقربة من ورقة الترشيح 10 مم في أي زاوية، وانقر على زر "تحليل" و "تعيين مقياس." املأ "المسافة المعروفة" لتكون "10 . "التحقق من المقياس هو الصحيح عن طريق قياس زاوية البديلة وضمان مدى قطرها ما بين 9،8 حتي 10،2 ملم. إذا لم يكن كذلك، كرر هذه الخطوة.

الرقم 2
ويرتبط نسخ ونسخة B. نسخة A (يسار) إلى إطار مكافحة الخلايا ويبقى عند 50٪ التكبير من أجل التناسق من هداف لهداف بينما نسخة B (يمين) قد يكون أسرع لتفضيل الفرد: الرقم 2.

2. يحرز FP عن طريق دنفر الحليمات بروتوكول بين شيئين مفتاح

  1. لكل مرشح papilلا، استخدم مفتاح شيئين التالية (الخطوة 2،2-2،5) تفاصيل معايير لتحديد ما إذا كان هو FP. انظر الشكل 3 للالبصرية من الحليمات التي تصنف على أنها FP وتلك التي يتم رفضها في كل خطوة في هذه العملية.
    الشكل (3) الرقم 3: FP مقابل رفض الحليمات. الشكل 3A هو اللسان مع العديد من تصفيات FP حين 3B-3E وقد حلقت المناطق التي تنتهك كل قاعدة. (3B) المنطقة غير متبلور. (3C) حليمات صغيرة جدا. 3D) حليمة باللون الأزرق بالمقارنة مع تلك التي تحيط به، (وتوقفت مقارنة 3E) حليمة عما حولها.
  2. شكل
    1. تحديد ما إذا كانت حليمة مرشح هو غير متبلور (بشع). في 50٪ زوم معرفة ما إذا كان هناك شكل هندسي المعترف بها عموما (البيضاوي، مكعبة، جولة).
    2. إذا كان هناك شكل هندسي (انظر الشكل 3A)، انتقل إلى الخطوة 2.3.
    3. إذا ذره لا يوجد شكل هندسي (انظر الشكل 3B)، انتقل إلى إطار مكافحة الخلية وانقر فوق "1. نوع" على نسخة A (50٪ التكبير)، انقر فوق حليمة مرشح لوضع علامة على أنها غير متبلور وليس FP. النقر على أنواع 4/1 في هذا المجال والخطوات اللاحقة يسمح الهدافين ليعلموا انهم تناول جميع الحليمات مرشح ويصنف الذي حكم قد انتهك عندما رفض هيكل التي سوف تساعد في المناقشة في الخطوة 2.7.2.
  3. اللون
    1. الرجوع إلى نسخ بنسبة 50٪ والتكبير وتحديد ما إذا كان هناك أي تمايز اللون على سطح اللسان. إذا كان الأمر كذلك، انتقل إلى 2.3.2 المقبل. إن لم يكن، لا تستخدم اللون باعتباره العامل الحاسم. الانتقال إلى الخطوة 2.4.
    2. تحديد ما إذا كانت حليمة المرشح هو أخف من الأنسجة أو الحليمات المحيطة به (انظر الشكل 3A). إذا ظلت أي جزء من حليمة مرشح الوردي أو ملطخة أخف وزنا، والانتقال إلى الخطوة 2.4.
    3. إذا كانت حليمة مرشح باللون الأزرق والحليمات المحيطة بهاأخف وزنا (انظر الشكل 3C)، انتقل إلى إطار مكافحة الخلية وانقر فوق "نوع 2" على العداد الخلية. على نسخة A، انقر المرشح للاحتفال كما الأزرق جدا وليس FP.
  4. حجم
    1. باستخدام نسخة B، تكبير لبعد المسافة حيث يمكن للمرء أن يرى بشكل مريح الخطوط العريضة للحليمة مرشح.
    2. انقر على أداة سطر وقياس عبر أطول البعد الحليمة مرشح. انقر على زر "تحليل" ثم "التدبير." إذا كان طول قياس 0.5 ملم أو أكثر (انظر الشكل 3A)، انتقل إلى الخطوة 2.5.
    3. إذا كان طول قياسه هو 0.499 ملم أو أقل، وقياس مرة أخرى لضمان الدقة. إذا كان لا يزال 0.499 ملم أو أقل (انظر F igure 3D)، انقر فوق "نوع 3" في إطار مكافحة الخلايا وعلى نسخة A، انقر حليمة مرشح للاحتفال أنها صغيرة جدا وليس FP.
  5. ركود
    1. باستخدام نسخة A، تقييم ما إذا كانت حليمة المرشح إما موحدة انهآيت مع بقية اللسان أو مرتفعة. إذا كانت حليمة هي في شق، وتحديد ارتفاعها مقارنة مع غيرها من الهياكل في شق، وليس على سطح اللسان. إذا كانت حليمة أقل من الحليمات المحيطة به (انظر الشكل 3E)، استخدم "نوع 4"، وانقر على نسخة A حليمة مرشح للاحتفال أنها توقفت وليس FP.
    2. إذا كانت حليمة مرشح إما من ارتفاع موحد مع بقية اللسان أو مرتفعة (انظر الشكل 3A)، استخدم "نوع 5" إلى فوقه وعلامة أن هذا هو FP. هذا المجموع اكتب 5 هو FP النتيجة الخام. لا تغلق النسخ في هذه المرحلة كما يماغيج لا يحفظ عشرات على العداد الخلية ولا علامات ملونة من أنواع 1-5 على نسخة A.
  6. توفير نسخ
    1. أكتب في دفتر الخام FP النتيجة.
    2. في إطار مكافحة الخلية، انقر فوق "تصدير صورة." وفروا مع نظام التسمية المطلوبة من المختبر. وهذا سوف يسمح افتتاح شرطيذ A في المستقبل للاحتفاظ علامات ملونة من أنواع 1-5. انها لن حفظ FP النتيجة الخام.
  7. ضبط الجودة
    1. يسجل كل صورة من قبل اثنين من الهدافين الفردي ومقارنة 7.
    2. إذا كان FP النتيجة الخام أعلى هي في حدود 10٪ لانخفاض درجة الخام FP، ومتوسط ​​درجات اثنين معا للحصول على درجة FP الآراء. إذا كان اثنان FP عشرات الخام تختلف بأكثر من 10٪، وسحب كل من الصور سجل على الشاشة.
      1. استخدام أنواع مضادة 1-4 للمساعدة في مناقشة التناقضات ويضفي على درجة التوافق النهائي. إذا تعذر التوصل إلى توافق في الآراء أثناء المناقشة، تأخذ استراحة من التهديف. في مرحلة لاحقة، rescore الصورة ومناقشتها. إذا كان الإجماع لا يزال لا يمكن التوصل، في سحب هداف الثالث. نطلب منهم أن يسجل صورة والحوار مع اثنين آخرين.

3. الهدافين التدريب على استخدام DPP

  1. خلفية عن التدريب
    1. واثنين من الهدافين العد مجموعة متنوعة من الصور،سجل بمفرده ويتشاور بانتظام للتأكد من أنها تستخدم نفس المعايير. فقط عندما كانت تهم الفردية باستمرار في حدود 10٪ من بعضها البعض لكل الصور عندما سجل هو طريقة (وضع اللمسات الأخيرة أعلاه) تعتبر مقبولة ووصف الحزب الديمقراطي التقدمي.
    2. اختيار 15 صورة رسمية و 15 صور التدريب (التكميلي أرقام 17/02) في ترتيب تسلسلي للتسجيل. إذا كان يعتبر صورة لا يحصى أثناء عملية الاختيار، تخطي الصورة واختر صورة متتابعة المقبلة.
      ملاحظة: هذه الصور تختلف من حيث الجودة والحجم لأنها اختيرت في حين أن مختبر كان لا يزال اتقان تقنية التصوير الصحيحة. واعتبرت واحدة من الصور المختارة لا يحصى من خلال هذا عملية الفرز الأولية ولكن لم يبق في ضمان الهدافين تمكنوا من جعل هذا النداء عند الحاجة. لذلك هناك 16 صورة معينة للمتدربين على الرغم من 15 فقط سجل الصور.
    3. عن طريق النيابة العامة، وترتيب هدافي الدوري المذكور أعلاه عد صور تدريب 15 و إيجاد توافق في الآراءيسجل لكل منها.
    4. إكساب المتدربين 15 الصور الرسمية ونسأل ليسجل باستخدام ميلر وريدي لإنشاء خط الأساس. عشرات قياسية. إجراء التدريب الجماعي التي أعقبت خطوة 3.2. مرة واحدة وقد تم الانتهاء الخطوة 3.2، لديها الهدافين يسجل 15 الصور الرسمية مرة أخرى وتسجيل نتائجهم.
  2. تدريب الهدافين اللاحقة على النيابة العامة
    1. إعطاء الهدافين التدريب الصورة التدريبية الأولى وإثبات النيابة العامة لالحليمات قليلة على هذه الصورة. مناقشة المنطق لاختيار أو رفض كل حليمة باعتبارها FP. السماح المتدربين على الاستمرار في ممارسة التهديف لبقية تلك الصورة وتشاور مع عدد الآراء (للمختبر حصلت على عدد التوافق واكتب 1-5 علامات، انظر التكميلي الشكل 1). هذه الصورة مناقشة أي اختلافات بغض النظر عن 10٪ لضمان فهم DPP.
    2. إعطاء الهدافين لاحق الصورة التدريبية الثانية، ويكون لهم يسجل باستخدام DPP.
    3. إذا كان المتدرب الخام FP النتيجة هي في غضون عشرةعد في المئة من الإجماع أنشئت من القسم 3.1.3، تسمح المتدرب للانتقال إلى الصورة التالية وكرر الخطوات.
    4. إذا كانت النتيجة هي خارج نطاق عشرة في المئة، استخدام علامات ملونة المتدرب تمثل أنواع 1-5 لفهم وتحديد التناقض ومن ثم معالجة الفهم المتفاوت للDPP.
    5. إعطاء المتدرب الفرصة لrescore الصورة وتحقق النتيجة الجديدة مرة أخرى. في حال نجاحها، المتدرب يتحرك على الصورة التالية حتى يتم الانتهاء من كل الصور.

Representative Results

وسجلت هنا صورة تمثيلية من قبل اثنين من الهدافين الفردي عند استخدام منهجية ميلر وريدي شائعة الاستخدام لتحديد FP استنادا إلى المعايير مجال الجولة، كبيرة، وردي أو ملطخة أخف وزنا، ومرتفعة، ثم سجل نفس الصورة من قبل اثنين من الهدافين استخدام النيابة العامة. التهم المعروضة هي تمثيلية من التباين الملحوظ باستخدام طريقة الأصلي بالمقارنة مع تباين أقل باستخدام DPP.

الرقم 4

الرقم 4: ميلر وريدي الكمي مقابل DPP الكمي الصورة على اليسار هو ممثل التهم اثنين من الهدافين 'باستخدام ميلر وريدي الطريقة. الصورة على اليمين تمثل تهمتين الهدافين 'باستخدام DPP. الأحمر هو هداف 1، الأصفر هو هداف 2، الأخضر هو الهدافين 1 و 2.

الموثوقية الإحصائية لموانئ دبيوP درس سابقا باستخدام نموذج خطي مختلطة لتقييم التغير 10. لفترة وجيزة، لتوليد البيانات لتقييم الدور الذي تلعبه النيابة العامة في اتساق الدرجات، وسجل خمسة عشر الصور مرتين. في أول دفعة من عشرات، وتستخدم DPP الهدافين السذاجة ميلر وريدي طريقة 2. وكان الهدافين ثم تدريبهم على استخدام النيابة العامة وكان rescored الصور بشكل فردي دون توافق خطوة النهائية هو موضح في القسم 2.7 تفاصيل ضبط الجودة (الشكل 5). كان FP مجموعة البيانات النتيجة المستخدمة في النموذج المختلط لتقييم الاختلافات جنبا إلى جنب نظرا لبروتوكول (الشكل 6)، التباين داخل هداف والتفاعل بينهما. وأظهر هذا النموذج اختلاف كبير في التهديف عند استخدام الأسلوب ميلر وريدي مقارنة DPP (ع القيمة <1 × 10 -6) مع النيابة العامة مما أدى إلى عدد أكبر من قبل 6.99 (SE = 0.99). كانت 5.2٪ من التباين في النتيجة بسبب التدريب، 25.9٪ نتيجة لهداف، والباقي بسببلتقلبه تحديدا إلى الصورة 10. المقبل، لتوليد البيانات لتحديد التباين داخل هداف، وسجل سلسلة من ثلاثين صورة في ترتيب عشوائي من قبل 11 شخصا. دون علم الهدافين، وتضمنت هذه السلسلة من الصور الثلاث الصور التي تكررت. لاحظنا الفرق الكبير في درجة تقلب مقارنة صور مميزة versusrepeated الصور.

الرقم 5
توفر DPP-السذاجة مقابل المشاركة DPP تدريب الفريق boxplots عشرات المعلقين على 15 صورة قبل وبعد التدريب بروتوكول الحليمات دنفر: الرقم 5. لكل boxplot، وشغل في دائرة يشير إلى متوسط ​​في حين أن دائرة مفتوحة تشير عزلاء.

الشكل (6)
الرقم 6: تغيير في هداف الفرق يمثل الرمادي ركان التباين الهدافين فردي قبل التدريب DPP. الأسود هو نفس المنصب هداف DPP التدريب.

Discussion

عن طريق النيابة العامة، والتباين داخل صورة التهم عبر الهدافين مستقل وانخفاض في عدد ضمن هداف بشكل ملحوظ. في حين أن هذا الأسلوب يجعل تحليل كثافة FP البصرية دون videomicroscopy أقل شخصي، تجدر الإشارة إلى أن هذا الأسلوب فقط عشرات FP. DPP لا يمكن أن تضمن أن الهياكل تصنف على أنها FP لها طعم المسام وبالتالي فهي الحليمات الذوقية ولا أن التهم هي تعكس الذوق الحقيقي كثافة برعم 20،23. وطبيعة هذا الأسلوب هو أنه يضع الموثوقية من خلال الاتساق والدقة؛ ومع ذلك، فإنه يمكن أن يتحامل النتائج في اتجاه ثابت. لاختبار دقة بالنسبة لأساليب أخرى باستخدام المقياس الحقيقي للطعم كثافة برعم (على سبيل المثال، videomicroscopy) أن تتجاوز نطاق هذه study.However، من خلال تحديد خصائص مورفولوجية FP أكثر صرامة وإنشاء مفتاح بين شيئين، ويتناول هذا الأسلوب ميلر & تهمة الريدي إلى الحقل الذي أكثر توصيف FPيجب القيام به من أجل الحصول على توافق في الآراء بشأن التشكل والكمي 2. بالإضافة إلى ذلك، فإنها أشارت إلى أن هذا التوصيف قد "يوضح بعض الاختلافات بين الموضوعات وشرح بعض النتائج المتباينة بين المحققين 2." من خلال توفير طريقة موحدة لالكمي، فإن العديد من التناقضات حول دور FP في الذوق وبالتغذية يمكن تصحيح البحوث ذات الصلة.

ويمكن تعديل المفتاح بين شيئين لمختلف تقنيات التقاط الصور. يمكن بسهولة أن يتم تعيين مسافة معروفة لالمقياس إلى القطر المستخدمة في كل مختبر والركود يمكن أن تكون مخفضة إذا وضعت التفاف ساران أو الزجاج على اللسان لالتقاط الصور. في مختبر حصلت، تبين أن اللسان محايد قدمت أفضل تعريف للالحليمات. قد يكون هذا بسبب كمية الضوء في المختبر مما تسبب التفاف ساران أو الزجاج لعكس الضوء مرة أخرى في الكاميرا خلق الوهج الذي جعل الحميرsment الصعب. وقال بعض المعامل وجدوا الصبغة أكثر تحديا لالعد، ولكن العثور على مختبر حصلت على المخفف صبغة الطعام الزرقاء بتركيز 01:36 قدمت النقيض المثالي بين كمئي الحليمات خيطية الشكل وعلى معظم الألسنة.

سوف إنشاء مفتاح بين شيئين لFP توصيف تسمح للباحثين في مختبرات مختلفة، وذلك باستخدام مجموعة متنوعة من أساليب التقاط الصور، لتحليل باستمرار الهياكل على لسان ولدي ثقة في الإبلاغ عن نتائجها. وأخيرا، استخدام مفتاح شيئين أن تكون لها أغراض في مناطق أخرى من منهجية علمية حيث الصفات الهياكل أو الأجسام توفر أرقام متناسقة من دراسة إلى أخرى.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من جائزة تعليم العلوم الشراكة (المصلحة) R25 RR025066 بين 2008-2012 من المعاهد الوطنية للصحة والمركز الوطني للبحوث الموارد. شكرا للزملاء في مجال طعم للنقاش العميق للأدب، نتائجنا وردود الفعل على استخدام النيابة العامة في مختلف السيناريوهات المختبر: جون هايز، سو كولدويل، بول بريسلين، كارلا شوبرت. شكرا لك أيضا على القيادة في متحف دنفر للطبيعة والعلوم والموظفين في دعم العلم مواطن في علم الوراثة من طعم مختبر في القطب الصحة. أخيرا، شكرا لكم جميعا لدينا المتطوعين العلماء المواطن على وقتهم والتفاني في تطوير واستخدام هذا البروتوكول، بما في ذلك: الدب أراغون، مايك آرتشر، سو أتامان، مايكل باجلي، A'nette برتراند، ديانا بويلز، ويندي السرية، ساشا دولي ، باتي Drever، جيسيكا ERN، لورا Harmacek، شون هيبارد، جويس Hutchens، مات جو، ليتا كين، ويليم Leenhouts، Stephania لوkjan، أشلي ماثيوز، مايك ماوزر، ستيفاني ميلر، هالى مورغان رودريجيز، غريفين Scherma، أليسا Schickedanz، تيري سيمون، ديلان توماس، رودي توريس، تايلر ويلسون، ديان Woltkamp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image J National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij
Food dye, Deep Blue Shade Esco http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
Sterile Rayon Tipped OB/GYN Applicators Puritan 25-808 1PR
Grade 1 Filter Paper Whatman Whatman No.: 1001-325
Coolpix P100 (10.3 megapixels) and P500 (12.1 megapixels) Nikon http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/ neither model appears to be available on the website any longer
Paper Hand Towels Kleenex https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, I. J. Human taste bud density across adult age groups. J Gerontol. 43 (1), B26-B30 (1988).
  2. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Quantification of fungiform papillae and taste pores in living human subjects. Chem Senses. 15 (3), 281-294 (1990).
  3. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Variations in Human Taste Bud Density and Taste Intensity Perception. Physiol Behav. 47 (6), 1213-1219 (1990).
  4. Shahbake, M., Hutchinson, I., Laing, D. G., Jinks, A. L. Rapid quantitative assessment of fungiform papillae density in the human tongue. Brain Res. 1052 (2), 196-201 (2005).
  5. Bartoshuk, L. M., Duffy, V. B., Miller, I. J. PTC/PROP tasting: anatomy, psychophysics, and sex effects. Physiol Behav. 56 (6), 1165-1171 (1994).
  6. Essick, G. K., Chopra, A., Guest, S., McGlone, F. Lingual tactile acuity, taste perception, and the density and diameter of fungiform papillae in female subjects. Physiol Behav. 80 (2-3), 289-302 (2003).
  7. Delwiche, J. F., Buletic, Z., Breslin, P. A. Relationship of papillae number to bitter intensity of quinine and PROP within and between individuals. Physiol Behav. 74 (3), 329-337 (2001).
  8. Kim, U. K., Jorgenson, E., Coon, H., Leppert, M., Risch, N., Drayna, D. Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide. Science. 299 (5610), 1221-1225 (2003).
  9. Hayes, J. E., Bartoshuk, L. M., Kidd, J. R., Duffy, V. B. Supertasting and PROP bitterness depends on more than the TAS2R38 gene. Chem Senses. 33 (3), 255-265 (2008).
  10. Garneau, N. L., et al. Crowdsourcing taste research: genetic and phenotypic predictors of bitter taste perception as a model. Front Integr Neurosci. 8 (33), (2014).
  11. Fox, A. L. The relationship between chemical constitution and taste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 18 (1), 115-120 (1932).
  12. Tepper, B. J., Nurse, R. J. Fat Perception is related to PROP taster status. Physiol Behav. 61 (6), 949-954 (1997).
  13. Duffy, V. B., et al. Bitter receptor gene (TAS2R38.), 6-n.-Propylthiouracil (PROP) bitterness and alcohol intake. Alcohol Clin Exp Res. 28 (11), 1629-1637 (2004).
  14. Yackinous, C., Guinard, J. X. Relation between PROP taster status and fat perception, touch, and olfaction. Physiol Behav. 72 (3), 427-437 (2001).
  15. Fischer, M. E., et al. Factors related to fungiform papillae density: The Beaver Dam Offspring Study. Chem Senses. 38 (8), 669-677 (2013).
  16. Feeney, E. L., Hayes, J. E. Regional differences in suprathreshold intensity for bitter and umami stimuli. Chemosens Percept. 7 (3-4), 147-157 (2014).
  17. Saito, T., Narita, N., Yamada, T., Manabe, Y., Ito, T. Morphology of human fungiform papillae after severing chorda tympani nerve. Ann Otol Rhinol Laryngol. 120 (5), 300-306 (2011).
  18. Miller, I. J. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. L. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
  19. Cheng, L. H. H., Robinson, P. P. The distribution of fungiform papillae and taste buds on the human tongue). Arch Oral Biol. 36 (8), 583-539 (1991).
  20. Cruickshanks, K. J., et al. Measuring taste impairment in epidemiologic studies-The Beaver Dam Offspring Study. Ann N Y Acad Sci. 1170, 543-552 (2009).
  21. McNamara, P. A. Genetics of Taste summative evaluation report prepared for Denver Museum of Nature & Science. Independent Evaluator. , Chicago IL. (2012).
  22. Arvidson, K., Friberg, U. Human taste: Response and taste bud number in fungiform papillae. Science. 209 (4458), 807-808 (1980).

Tags

علم الأعصاب، العدد 100، كمئي الحليمات، الذوق، ذوقي، الكمي، اللسان، FP، بين شيئين مفتاح، التغذية، طريقة
بروتوكول الحليمات دنفر للتحليل الموضوعي لكمئي الحليمات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nuessle, T. M., Garneau, N. L.,… More

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter