To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
For å føre endovaskulære infeksjoner og infeksiøs endokarditt, bakterier må være i stand til å følge fartøyet veggen mens å bli utsatt for skjærspenning av rennende blod.
Å identifisere bakterie- og vertsfaktorer som bidrar til vaskulær vedheft av mikroorganismer, er hensiktsmessige modeller som studerer disse interaksjonene under fysiologiske skjærbetingelser nødvendig. Her beskriver vi en in vitro modell strømningskammer som gjør det mulig å undersøke bakteriell adhesjon til forskjellige komponenter i den ekstracellulære matriks eller til endotelceller, og en intravital mikroskopi-modell som er utviklet for direkte å visualisere den første adhesjon av bakterier i innvoller sirkulasjon in vivo . Disse metodene kan brukes til å identifisere de bakterielle og vertsfaktorer som kreves for adhesjon av bakterier i henhold til flyt. Vi illustrerer relevansen av skjærspenning og rollen til von Willebrand-faktor for adhesjon av Staphylococcus aureus med både in vitro og in vivo modell.
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Skjærspenning er en avgjørende faktor for den tidlige bakteriell adhesjon til beholderveggen, og for den etterfølgende dannelse av endovaskulær eller endokardiale vegetasjoner og metastatiske infeksjoner 4,5. Vi beskrevet komplementær in vitro og in vivo modeller for å undersøke patogenesen av endovaskulære infeksjoner under fysiologiske skjærspenning. Disse modellene har tillatt oss å identifisere von Willebrand-faktor-bindende protein (vWbp) som den store S. aureus protein til å samhandle henhold flyt med en skadet vaskulær vegg utsette VWF 4.
Endovaskulære infeksjoner, og infeksiøs endokarditt spesielt, er av interesse ikke bare på grunn av sepsis-indusert organsvikt og død, men også på grunn av lokale og fjernt ('metastatiske') komplikasjoner. Å forårsake infeksiøs endokarditt og metastatisk infeksjoner, bakterier måtte forholde seg til åreveggen og dermed motstå skjærspenning av rennende blod. Meststudier på bakterier virulensfaktorer er utført i statiske forhold. Men kanskje disse etablerte interaksjoner ikke tåler skjærkrefter og studier i henhold strømningsforhold kan avsløre nye, tidligere ikke faktorer i bakterier-host samspill.
Ved hjelp av mikro-parallelle strømningskammeret, har vi og andre vist betydningen av VWF for vaskulær adhesjon. Under skjærspenning, VWF gradvis utfolder seg fra sin hvile kuleformet struktur, og eksponerer A1 domene som samhandler med blodplater via sin GPIb reseptor 6. Flyt kamre har vært mye brukt til å studere blodplatefunksjon 7.
Bemerkelsesverdig, også S. aureus adhesjon i henhold til strømnings krever VWF, og spesielt A1 domenet som er eksponert på skjærkraft. Vi identifiserte vWbp å megle VWF bindende. vWbp er en koagulase som bidrar til S. aureus patofysiologien ved å aktivere vertens protrombin. Staphylothrombin, resulting kompleks av en bakteriell koagulase og protrombin, omdanner fibrinogen til uløselig fibrin 8,9. Våre undersøkelser har vist at vWbp ikke bare aktiverer protrombin, men utløser dannelsen av bakterie fibrin-blodplate-aggregater, som forbedrer adhesjonen til blodkarene i henhold til strømnings 4,10,11.
In vitro strømningskamret modellen gjør det mulig å studere de ulike aktørene i bakteriell adhesjon til mobilnettet eller matrikskomponenter. Bakterielle virulens faktorer kan studeres ved hjelp av mutanter eller uskadelige bakterier som uttrykker spesifikke overflateproteiner. Alternativt kan farmakologiske inhibitorer eller blokkerende antistoffer tilsettes til mediet i strømningskammeret. Rollen av vertsfaktorer for eksempel ulike bestanddeler av ekstracellulær matriks kan studeres ved hjelp av dekkglass med forskjellige belegg. Objektglassene kan også være dekket med endotelceller, hvor aktiveringsstatusen kan moduleres ved tilsetning av bestemte stimulatorer. Apart fra karveggen, kan bidraget fra vertsblodceller og plasmaproteiner bli studert ved å tilsette disse faktorene til det strømmende mediet. Dermed kan ulike forhold av økende kompleksitet bli studert under standardiserte betingelser for laminær å avdekke interaksjoner som tillater bakterier å følge åreveggen in vivo.
Interaksjoner identifisert i in vitro modellen blir deretter undersøkt i en dyremodell for å teste deres relevans i et kompleks organisme. Andre in vivo modeller for å studere interaksjoner dynamiske henhold strømmen er blitt beskrevet, slik som hamster dorsal skinfold kammeret 12 og cremaster modell 13. Til sammenligning mesenteriske perfusjon modellen beskrevet her gir flere fordeler på grunn av sin brukervennlighet, muligheten til å variere vert genetisk bakgrunn av musene og å vurdere medikamentelle tiltak.
I konklusjonen, den beskrevne modellertilbyr muligheten for å studere overflateproteiner ikke bare av S. aureus, men fra mange andre mikroorganismer i ulike verts bakgrunn, for bedre å forstå patogenesen av vaskulære infeksjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Eddy Merckx stipend" og "Sporta forskning Grant" for Pediatric Cardiology, UZ Leuven, Belgia (JC); Center for Molecular and Vascular Biology støttes av Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), av "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) fra Universitetet i Leuven og et forskningsstipend fra Boehringer-Ingelheim.
Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera |