Method Article

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

DOI:

10.3791/52863

⸱

May 21st, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Michigan, 3Department of Epidemiology and Biostatistics, Michigan State University, 4Department of Molecular Obstetrics and Genetics, Wayne State University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 6Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описан протокол для выделения и дальнейшего изучения инфильтрирующих лейкоцитов decidua basalis и decidua parietalis - границы между матерью и плодом человека. Этот протокол поддерживает целостность маркеров клеточной поверхности и позволяет получить достаточное количество жизнеспособных клеток для последующего применения, что доказано анализом проточной цитометрии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Беременность характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в репродуктивных тканях и на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis). Этот интерфейс анатомическая контакта между материнской и эмбриональных тканей; Таким образом, это иммунологическое местом действия во время беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода играют центральную роль в имплантации, обслуживание беременности, и сроки доставки. Таким образом, фенотипические и функциональные характеризации этих лейкоцитов обеспечит понимание механизмов, приводящих к нарушению беременности. Несколько протоколы были описаны для того, чтобы изолировать от проникновения лейкоцитов децидуальной базального и децидуальной parietalis; Однако, отсутствие согласованности в реагентов, энзимов, и времени инкубации затрудняет сравнение этих результатов. Описанный в настоящем документе, новый подход, который сочетает в себе использование нежных механических и ферментативных диссметоды ociation сохранить жизнеспособность и целостность внеклеточного и внутриклеточного маркеров в лейкоцитах, выделенных из тканей человека на границе материнской плода. Помимо иммунофенотипирования, культуры клеток, и сортировки клеток, будущие применения этого протокола многочисленны и разнообразны. После этого протокола, выделенные лейкоциты могут быть использованы для определения метилирование ДНК, экспрессию генов-мишеней, в пробирке функциональности лейкоцитов (т.е. фагоцитоза, цитотоксичность, пролиферацию Т-клеток, и пластичности и т.д.), а также производство активных форм кислорода на границе материнской плода. Кроме того, с помощью описанного протокола, эта лаборатория была в состоянии описать новые и редкие лейкоциты на границе материнской плода.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Беременность характеризуется тремя различными иммунологическими фаз: 1) имплантация и в начале плаценты связаны с про-воспалительной реакции (т.е., имплантация напоминает "открытая рана"); 2) во втором триместре, и большинство из третьего триместра беременности, когда иммунного гомеостаза достигается через преимущественно противовоспалительным государства на границе материнской плода; и 3) роды, про-воспалительных состояние 1-7. Иммунные клетки играют важную роль в регуляции воспалительной реакции на границе материнской плода, где их численность и изменение локализации во время беременности 6-9.

У человека, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подходит для изоляции лейкоцитов из децидуальной базального и децидуальной parietalis в подготовке к иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Кроме того, отдельные клетки могут быть использованы для сортировки клеток, культуры клеток, выделения РНК, и цитологии. Перед началом работы с образцами, указанных в этом протоколе, этические утверждения человеческого должно быть получено от Комитета по этике местного научно-исследовательского и организационного обзора советов. Сбор и утилизация образцов человека для исследовательских целей были одобрены этическими советами Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и раз....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. Рассечение тканей человека на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis) показано на рисунке 1 Эта процедура включает в себя вскрытие донца, которое включает децидуальной базального (рис 1А - D). Децидуальной базального получается удалением плацентарный ворсинки (со стороны плода) от базальной пластинки (рис 1С). Децидуальной parietalis собирают путем осторожного соскоба хорионический мембраны (рис 1E

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика функциональных и фенотипических свойств проникновения лейкоцитов в интерфейсе материнской плода человека имеет важное значение для понимания иммунных механизмов, приводящих к нарушению беременности. Некоторые методы были описаны для того, чтобы изолировать лейкоциты из интерфейса материнской плода человека на протяжении всей беременности 10,14,25,28,37,42,43. Тем не менее, каждый из этих методов отличается, использует разные ферменты или комбинации ферментов, требуется разное время диссоциации,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не раскрывают конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития, NIH / DHHS. Эта работа также была поддержана, в частности, в университет перинатального инициативы Wayne State в материнской, перинатальной и детского здоровья. Мы выражаем глубокую признательность Морин McGerty (Wayne State University) за критических показаний рукописи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection
Инструменты для препарирования: хирургические ножницы, щипцы и пинцет с тонким наконечником Любой поставщик20012-027
1X фосфатный буферный раствор (PBS)Life Technologies(1X PBS)
Большие и маленькие чашкиПетри любой поставщик
Dissociation
AccutaseLife TechnologiesA11105-01(раствор для отслоения клеток)
Стерильные 2 мл безопасные конические пробиркиЛюбые
50 мл конические центрифужные пробиркиЛюбой поставщик
100 & микро; m клеточные фильтрыFALCON/Corning352360
5 мл полистирольные пробирки с круглым дномЛюбой производитель
Трансферные пипеткиЛюбой поставщик
C пробиркиMiltenyi Biotec130-093-237
Cell Culture
RPMI питательная среда 1640 Life Technologies22400-089(1X) (10% FBS и 1% P/S)
Пластиковые камерные слайдыThermo Scientific177437
ИнкубаторThermo Scientific CorporationHEPA Class 100
Водяная баняFisher ScientificISOTEMP 110
Счетчик клетокNexelcomCellometer Auto2000
МикроскопOlympusOlympus CKX41
Cell Separation
MS колонкиMiltenyi Biotec130-042-201
Сепаратор клетокMiltenyi Biotec130-042-109
30 μ m фильтры предварительной сепарацииMiltenyi Biotec130-041-40
MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
15 мл сейф-лок конические пробиркиЛюбой производитель
MACS буфер (0,5% бычьего сывороточного альбумина, 2 мМ ЭДТА и 1X PBS)
Reagents
FcR BlockingMiltenyi Biotec130-059-901(Fc Block)
Антитела к поверхностному антигену клеток человека BD Biosciences(Таблица 1)
Сывороточный альбумин крупного рогатого скота SigmaA7906
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ красительжизнеспособности BD Biosciences564406
Лиз/Фикс буфер BD Biosciences346202
буфер FACS (0,1% БСА, 0,05% азида натрия и 1X PBS, рН=7,4)
Буфер для окрашивания BD Biosciences554656
Trypan Blue раствор 0,4%Life Technologies15250-011
FicollGE Healthcare17-1440-0220% градиентная среда плотности (1,077 + 0,001 г/мл)
Дополнительные инструменты
Инкубатор с шейкеромThermo ScientificMAXQ 4450
Проточный цитометрBD BiosciencesLSR-Fortessa
 Beckman CoulterSpinChron DLX
Вакуумная системалюбого производителя
Автоматический диссоциатор тканей ДиссоциаторMiltenyi Biotec
поставщик Центрифуга gentleMACS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
  2. Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
  3. Romero, R., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Leukocyte IsolationMaternal Fetal InterfaceDecidual TissueMechanical DisaggregationEnzymatic DigestionDensity Gradient CentrifugationCell Strainer FiltrationImmunophenotypingCell ViabilityFunctional Assays

Related Articles