Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Myxovirus weerstand (Mx) eiwitten zijn een belangrijk onderdeel van de aangeboren afweer tegen virale ziekteverwekkers. Deze eiwitten zijn groot dynamin-achtige GTPases die worden geïnduceerd door type I en type III interferonen. De overeenkomstige Mx genen aanwezig in bijna alle gewervelde dieren in een of meerdere kopieën en hun genproducten remmen een groot aantal virussen, waaronder Orthomyxoviridae (bv., Influenzavirus), Rhabdoviridae (bijv., Vesiculaire stomatitis virus), Bunyaviridae (bijv. , La Crosse virus) en Retroviridae (bijvoorbeeld humaan immunodeficiëntievirus-1) 4/1. Het is onduidelijk hoe deze eiwitten herkennen zo'n breed scala aan virussen, zonder duidelijke gedeeld primaire sequentie motieven in deze virussen. Het analyseren van de interactie van Mx-eiwitten met hun virale doelen, mogelijk met hogere orde complexen met andere gastheercel factoren, zal helpen om de moleculaire mechanismen te begrijpen thoed zijn geëvolueerd in de wapenwedloop tussen virussen en hun gastheren.
De interactie tussen zoogdieren Mx eiwitten en virale targets is het meest uitgebreid bestudeerd voor menselijke MxA. Menselijke MxA kan de replicatie van veel virussen, waaronder de orthomyxovirussen influenza A en Thogoto virus remmen. MxA bindt Thogoto virus ribonucleoproteïne complexen (vRNPs), waardoor hun nucleaire binnenkomst, waardoor blok infectie 5 voorkomen. Deze interactie tussen MxA en Thogoto virus vRNPs aangetoond met co-sedimentatie en co-immunoprecipitatie experimenten 6-9. Hoe Mx eiwitten hinderen influenza A-virussen is minder duidelijk. Een groot probleem is dat het niet eenvoudig om een interactie tussen een eiwit en Mx een influenza genproduct tonen. Een rapport toonde een interactie tussen mens MxA en de NP-eiwit in het influenza A-virus geïnfecteerde cellen 10. Deze interactie kan alleen worden aangetoond door co-immunoprecipitation als de cellen waren behandeld met de verknopingsreagens dithiobis (succinimidylpropionaat) voor lysis, wat suggereert dat de interactie van voorbijgaande aard en / of zwak. Recentere studies hebben aangetoond dat de differentiële Mx gevoeligheid van verschillende influenza A-stammen wordt bepaald door de oorsprong van het NP-eiwit 11,12. In lijn met deze, kan influenza-A-virussen deels ontsnappen uit Mx controle door het muteren van specifieke resten in het NP eiwit 13. Dit suggereert dat de belangrijkste doelstelling van influenza A virussen gastheer Mx NP eiwit, waarschijnlijk NP geassembleerd vRNP complexen. Geen van deze recentere studies toonden een interactie tussen influenza NP of vRNPs en humaan MxA of muis Mx1.
Onlangs toonden wij voor het eerst een interactie tussen influenza NP en muis Mx1 eiwit met een geoptimaliseerde co-immunoprecipitatie protocol 14, dat hier wordt beschreven. In het algemeen co-immunoprecipitation is een van de meest gebruikte biochemische methoden om proteïne-proteïne interacties te onderzoeken. Deze techniek wordt vaak de voorkeur boven andere technieken, bijvoorbeeld gist twee hybride, aangezien het eiwit-eiwit interacties in hun natuurlijke omgeving onderzoeken. Co-immunoprecipitatie kan op endogeen tot expressie gebrachte eiwitten worden uitgevoerd als antistoffen tegen de eiwitten van belang zijn beschikbaar. Alternatief kunnen de eiwitten van belang tot expressie worden gebracht in de cel door middel van transfectie of infectie en een affiniteit tag worden gebruikt. Naast de hierboven genoemde voordelen, beschreven co-immunoprecipitatie protocol maakt de detectie van zwakke en / of transiënte eiwit interacties. Het hoofdbestanddeel van deze geoptimaliseerde protocol is de toevoeging van N-ethylmaleimide (NEM) voor cel lysis buffer. NEM is een alkylerend reagens dat reageert met vrije thiolgroepen zoals aanwezig in cysteïnen bij een pH van 6.5-7.5, een stabiele thio-ester(Figuur 1). Bij hogere pH kan NEM ook reageren met aminogroepen of ondergaat hydrolyse 15. NEM wordt typisch gebruikt om vrije thiolgroepen te blokkeren, teneinde vorming van disulfidebindingen te voorkomen of remmen enzymatische activiteit. Zo wordt NEM vaak gebruikt om desumoylating enzymen die cysteïne proteasen blokkeren. In het beschreven co-immunoprecipitatie protocol werd NEM eerst in het lysisbuffer, omdat was gemeld dat de sumoylation van influenza eiwitten interactie tussen virale eiwitten 16 kunnen beïnvloeden. Onverwacht toevoeging NEM gebleken om de interactie tussen influenza NP en muis Mx1 door co-immunoprecipitatie document. Het is onduidelijk waarom de toevoeging NEM is cruciaal voor de NP-Mx1 interactie detecteren. Mogelijk is de interactie is ook van voorbijgaande aard en / of zwak. NEM kon de interactie, bijvoorbeeld stabiliseren, door het behoud van een specifieke conformatie van Mx1, een viraal eiwit of zelfs een onbekende derde component. Een dergelijke stabiliserende effect NEM eerder is opgemerkt, bijvoorbeeld voor de interactie tussen de ribonucleotide reductase M1 en zijn inhibitor gemcitabine (F2dC) 17. MX1 en NP beide bevatten meerdere cysteïneresiduen die door NEM kan worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, een recente studie van Rennie et al. Aangetoond dat een stalkless MxA-variant bevat drie oplosmiddel cysteine residuen die door iodoacetamide kan worden gewijzigd. Muteren deze residuen serinen heeft geen invloed op de enzymatische activiteit van MxA, maar voorkomen disulfide gemedieerde aggregatie 18. Aangezien deze cysteïnen zijn geconserveerd in Mx1, suggereert dit dat de analoge cysteïnen in Mx1 door NEM en als zodanig beïnvloeden de conformatie of oplosbaarheid kan worden gewijzigd. Bovendien kan NEM van invloed op de GTPase activiteit van Mx1, die essentieel is voor de anti-influenza werking van Mx1 en daardoor de interactie tussen Mx1 en NP stabiliseren. Echter, een direct effect van NEM op de GTPase activiteit van Mx1 onwaarschijnlijk, zoals NEM moet ook de interactie tussen influenza NP en GTPase inactieve mutanten van het Mx1 eiwit 14 te detecteren. Het is duidelijk dat er meer onderzoek nodig is om het effect van NEM op de NP-Mx1 interactie te ontrafelen.
Samengevat, de beschreven co-immunoprecipitatie protocol kan de interactie tussen de antivirale Mx1 eiwit en virale doel, het influenza NP-eiwit te bestuderen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om andere zwakke of voorbijgaande interacties die afhankelijk zijn van de stabilisatie van specifieke eiwitten conformaties bestuderen. Eiwit-eiwit interacties die door specifieke conformaties zijn eerder beschreven, bijvoorbeeld voor calcium bindende eiwitten zoals calmoduline 19. Tenslotte, de gunstige rol NEM kan ook worden gebruikt in andere werkwijzen die eiwit-eiwit interacties, zoals co-sedimentatie assays detecteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bestuderen van de interactie tussen antivirale eiwitten en hun virale targets is zeer belangrijk voor de details van de antivirale mechanisme van deze eiwitten te begrijpen. Dit kan nieuwe inzichten in hoe virussen en hun gastheren mede-geëvolueerd te geven en zijn de basis voor de ontwikkeling van nieuwe antivirale strategieën. De geoptimaliseerde co-immunoprecipitatie hier beschreven protocol laat de interactie tussen de muis Mx1 eiwit en virale doel, het influenza NP-eiwit te bestuderen. Het belangrijkste aspec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het FWO-Vlaanderen, het IOF project IOF10 / StarTT / 027 en de Universiteit Gent Special Research Grant BOF12 / GOA / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
References
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
