מתואר כאן הקמת מודל ניתוח קטרקט מדומה ex vivo רלוונטי מבחינה קלינית שניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים של תגובת הפגיעה של רקמות אפיתל בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
המכשול העיקרי להבנת האופן שבו רקמת אפיתל מבצעת תיקון פצע הוא הזמינות המוגבלת של מודלים שבהם ניתן לעקוב ולתפעל את תגובת הפצע ex vivo בסביבה המחקה מקרוב את זו של פגיעה ברקמת אפיתל in vivo. בעיה זו טופלה על ידי יצירת מודל אפיתל רלוונטי קלינית לתיקון פציעות ex vivo המבוסס על ניתוח קטרקט. במודל תרבית זה, ניתן לעקוב אחר תגובת אפיתל העדשה לפציעה בשידור חי במיקרו-סביבה הטבעית של התאים, והמתווכים המולקולריים של תיקון הפצע ניתנים למניפולציה בקלות במהלך תהליך התיקון. להכנת התרביות מסירים עדשות מהעין ומבצעים חתך קטן בחלק הקדמי של העדשה ממנו מסירים את המסה הפנימית של תאי סיבי העדשה. הליך זה יוצר פצע מעגלי על קפסולת העדשה האחורית, קרום הבסיס העבה המקיף את העדשה. אזור פצע זה שבו חוברו תאי הסיבים ממוקם ממש בסמוך לשכבה חד-שכבתית רציפה של תאי אפיתל עדשה שנשארת מחוברת לקפסולת העדשה במהלך ההליך הכירורגי. האפיתל הפצוע, סוג התא שממנו נגזרים תאי סיבים במהלך ההתפתחות, מגיב לפגיעה של הסרת תאי סיבים על ידי תנועה קולקטיבית על פני אזור הפצע, בהובלת אוכלוסייה של תאי תיקון עשירים בווימנטין שאבותיהם המזנכימליים הם אנדוגניים לעדשה1. תכונות אלו אופייניות לתגובת ריפוי פצעי אפיתל רגילה. במודל זה, כמו in vivo, תיקון פצע תלוי באותות המסופקים על ידי הסביבה האנדוגנית הנשמרת באופן ייחודי במערכת תרבית ex vivo זו, ומספקת הזדמנות אידיאלית לגילוי המנגנונים המווסתים את תיקון האפיתל לאחר פציעה.
מבוא
ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג'פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון.
1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע
- הנח שלוש 100 מ"מ צלחות פטרי ב, זרימה למינרית סטרילי. מלא שתי צלחות פטרי באמצע הדרך עם חיץ טריס / דקסטרוז (חיץ TD, 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ Na 2 PO 4, 5 מ"מ D-גלוקוז, 8.25 מ"מ טריס בסיס, pH 7.4 עם HCl) ב RT , עוזב את ריק שלישי. תקשורת ותרבות טרום חמה (199 מדיה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים
לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר מרקמת עדשה המציעה יתרונות רבים בשל המאפיינים הפנימיים שלה: 1) העדשה היא איבר עצמאי מוקף קרום במרתף עבה נקרא הקפסולה העדשה; 2) זה avascular, 3) לא innervated ו -4) ללא סטרומה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן מתוארת טכניקה להכנת מודל תרבית לתיקון פצעים הכוללת ביצוע ניתוח קטרקט ex vivo בעדשות עוברי אפרוחים לאחר הסרתן מהעין. אפיתל העדשה מגיב לפציעה רלוונטית קלינית זו בתהליך תיקון המחקה מקרוב את זה המתרחש in vivo, וחולק תכונות עם תיקון פצעים ברקמות אפיתל אחרות2,4. בעוד שהפרוטוקול פשוט ופשוט לביצוע, ביצוע ניתוח קטרקט מדומה עם עדשות עובריות דורש פיתוח מיומנויות בטיפול ברקמות קטנות שניתן לרכוש בתרגול, שכן קוטר העדשות העובריות הוא כ-2 מ"מ בלבד. הליך ניתוח הקטרקט מבוצע תחת מיקרוסקופ הניתוח, והשלבים הט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות ל-A.S.M. (EY021784).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נתרן כלורי (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | שימוש ב-140 מ"מ ב-TD Buffer |
| אשלגן כלורי (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | שימוש ב-5 מ"מ ב-TD Buffer |
| נתרן פוספט (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | שימוש ב-0.7 מ"מ במאגר TD |
| D-גלוקוז (דקסטרוז) | Fisher Scientific | D16-500 | שימוש ב-0.5 מ"מ במאגר TD |
| Tris | Base Fisher | Scientific BP152-1 | שימוש ב-8.25 מ"מ במאגר TD |
| חומצה הידרוכלורית | פישר סיינטיפיק | A144-500 | שימוש במאגר pH TD ל-7.4 |
| מדיה 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-גלוטמין | קורנינג/CellGro | 25-005-CI | שימוש ב-1% במדיה199 |
| פניצילין/סטרפטומיצין | קורנינג/ CellGro | 30-002-CI | שימוש ב 1% ב Media199 |
| 100 מ"מ צלחות פטרי | פישר סיינטיפיק | FB0875711Z | |
| Stericup יחידת מסנן | Millipore | SCGPU01RE | השתמש לסינון עיקור |
| מלקחיים Media Dumont #5 (צורך 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 מ"מ צלחת תרבית תאים | קורנינג | 430165 | |
| 27 גרם 1 מ"ל SlipTip עם מחט החלקה מדויקת | BD | 309623 | |
| מספריים עדינות | כלי מדע עדינים | 14058-11 | |
| מלקחיים סטנדרטיים | כלי מדע עדינים | 91100-12 | |
| פריטים אחרים דרושים: מכשירי דיסקציה כלליים, ביצי עוף לבנים פוריים, בדוק חממת ביצים (לחות, 37.7° C), מכסה זרימה למינרית, מיקרוסקופ |
מקורות
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
