전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
광학 해상도 및 투과 전자 현미경에서 특정 단백질 집단을 식별 도전 제한은 세포 생물학에서 장애물왔다. 많은 현상 시스템의 단순화 된 시험 관내 분석에 의해 설명과 완전하게 이해되기 위하여, 특히 1 nm 내지 0.1 ㎛의 범위 사이에, 반응계 내에서 추가 구성 정보를 필요로 할 수 없다. 여기서, 전자 분광 이미징, 단백질 및 핵산의 분포의 동시 맵핑을 허용 투과 전자 현미경 기법 및 식 태그 miniSOG은 DNA 이중 가닥 브레이크 수리 병소의 구조 및 조직을 연구하기 위해 결합된다.
Introduction
최근 몇 년 동안 1 이상의 광학 현미경에서 상당한 발전에도 불구하고, 세포 생물 학자들은 여전히 해상도의 차이로 고통. 이 고분자 복합체 간의 상호 조정을 수반 기본적인 세포 과정의 구조 – 기능 관계의 이해를 제한 (예를 들어, 크로 마틴 리모델링, DNA 수리, RNA의 전사 및 DNA 복제에). 투과형 전자 현미경 (TEM)이 필요한 해상도를 제공이야 있지만, 또한 시각 구조 생화학 적 조성물을 판별 할 수있는 동안 특정 단백질 라벨을 구조적으로 인해 무능력 이러한 프로세스를 정의하는 도전되었다. 핵 구조를 차별화하기 위해, 내부의 막 부재에있어서, 핵은 특히 도전왔다. 전자 분광 영상 (ESI)는 DNA, RNA, 및 PROT의 동시 검출 및 분화를 허용함으로써 이러한 제한 사항 중 일부를 해결핵 구조 2-5 EIN 기반.
전자 분광 영상 :
전자 현미경에서의 높은 감도 및 해상도의 원소 분포를 맵핑하기 위하여, 하나는 비탄 성적 시편 (6) 소자의 내부 쉘 전자와의 상호 작용을 통해 산란 된 전자를 선택 촬상 분광계를 사용할 수있다. 에너지의 원소가 특정 량의 시료 원자의 이온화의 결과로 소실되기 때문에,이 전자를 분리하고, 전자 현미경에 부착 된 분광계를 이용하여 가시화 될 수있다. 따라서, 검체와 상호 작용 한 전자 스펙트럼의 분석 시료 7의 원소 조성에 대한 정량적 정보를 보여준다. 시료를 통과 할 때의 에너지를 잃지 않는 전자는 전자 에너지 손실 "제로 손실의 피크"에서 발견스펙트럼. 이러한 전자 풍부 시험편의 질량, 밀도 및 두께에 관련되고, 시료에 충돌 또는 시험편을 통과하는 동안 에너지를 손실하지 않고 시료를 통과하는 전자가 구성된다. 이 정보는 시료 8의 특정 원소 존재의 원자 수의 절대 정량에 유용 할 수있다.
생물학적 시료는 중금속을 사용하는 대부분의 저조한 TEM 입사 빔 내의 전자를 편향 광 소자, 염색 방법으로 구성되어 있기 때문에 염 샘플 콘트라스트를 생성하기 위해 적용되어야한다. 이들 조영제 및 무능력 대부분 특이성이 가능 하나 이상의 얼룩을 시각화하는 특이성의 결여는 핵의 연구에서, 종래의 전자 현미경의 값을 한정 하였다. ESI 특히 세포 핵의 구조 연구를 위해, 종래의 TEM에 비해 상당한 장점을 갖는다.이는 단백질 복합체로부터 핵 단백질 복합체를 구별하는 핵산들의 밀도에 기초하여 다른 핵 단백질 복합체를 해결하기 위해 DNA- 및 RNA 함유 고분자 복합체 인 풍부한 자연을 활용하는 것이 가능하다. 나머지 생체 물질을 질소의 그 풍부한 기반으로 묘화 될 수있다. 다른 해부학 적 구조 내에서의 분포와 상대 풍요의 매핑 바로이 두 요소와 분석은 핵에 대한 많은 정보를 우리에게 제공한다. 예를 들어, 염색질 및 인을 풍부하게 표현하는 맵 리보솜을 쉽게 식별 할 수있다. interchromatin 공간 핵공 복합체와 핵 체는, 다른 한편으로는, 쉽게 질소 맵 이미지에서 검출 될 수있다.
미니 중항 산소 발생기 시스템 (miniSOG)
ESI는 강력한 기술을 나타낸다는 가지고 있기 때문에 현장 크로 마틴 구조에서 공부하기인 및 질소 원소 사이의 조성 비율의 특성의 장점은, 원소 조성은 일반적으로 단백질 복합체의 여러 집단 구별하는데 사용될 수 없다. 나노 미터 범위의 작은 금 입자로 표지 된 항체는 널리 개별 분자의 위치를 매핑하는데 사용되어왔다. 금 입자는 일반적으로 이차 항체에 부착되어 있기 때문에, 차 항체에 의해 검출 에피토프 주위 약 20nm의 원주 내에 표시한다. 매립 후 샘플에서, 항체는 단 부분의 표면에 노출 된 에피토프를 검출 할 수있다. 그것은, 얻어진 정보를 항원의 존재를 입증하고 셀의 특정 해부학 적 구조에 관련시키는 것이 가능하지만 에피토프의 대부분이 수지에 의해 가려 때문에, 불완전하다. 걸쳐 항원에 대한 액세스를 허용, 형광 현미경에 사용되는 것과 유사한 프로토콜을 사용하는 기술을 미리 매립시료의 전체 깊이 있지만, 일반적 지질막의 제거를 요구하고 알데하이드에 의해 고정 될 수없는 요소를 제거 항체가 세포에 침투하도록 허용해야 투과성으로 단계. 또한, 미세 구조 보존, 글루 타르 알데히드에 대한 선호 알데히드 정착액은, 일반적으로 그 결과, 파라 포름 알데히드는 일반적으로 필요하며, 항원을 파괴하고. 이 단백질 – 단백질 가교에 덜 효과적이다. 금 나노 입자와 함께 표시되어 항체의 또 다른 단점은 금이 약한 콘트라스트가 샘플, 흥미로운 세부 구조를 모호 할 수있는 강한 대비를 생성하는 매우 전자 밀도가 높은 물질 것입니다.
발현 된 단백질 태그와 같은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 출현은 세포 생물학의 질문에 대답하기 위해 형광 현미경의 사용을 변형시켰다. 작은 형광 도메인과 단백질에 태그를 지정하면 생체 내에서 유통의 매핑을 할 수 있습니다 </em>의 구조를 변경할 수 투과성으로 절차 없이도. 현미경 일렉트론 세포 단백질 분포를 매핑하는 단백질 태그 사용의 우아한 원리를 번역하기 위해, 시스템은 관심 구조 신호 확대를 제조하고 TEM에 콘트라스트를 생성 할 수 있다는 것을 필요로 하였다. 중합 미노 종종 결합 항체를 검출하기 위해 사용된다 조직학 얼룩이다. 이 얼룩은 일반적으로 이차 항체에 접합 된 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)를 사용하여 증착된다. 반응이 안정적인 결과를 생성하지만, HRP는 셀 (9)의 세포질에 촉매 활성이 아니다. 그들의 해상도 nanogold 방법 10보다 더되도록 HRP의 반응 생성물도 생성 부위에서 멀리 확산 될 수있다. 이러한 문제를 우회하기 위해, 플래시 / ReAsH 시스템 (11)을 개발 하였다. 그것은 tetracysteine 모티브를 가지고 재조합 융합 단백질로 구성되어 있습니다. 이 모티브의 결합을 할 수 있습니다biarsenic 형광. 여기 된 때, 결합 또는 플래시 ReAsH는 태그 단백질의 부위에서 즉시 침전 합체에 고도로 반응성 일 중항 산소 따라서 photoconvert 디아 미노 벤지딘 (DAB)를 생성 할 수있다. DAB 중합체는 전자 밀도가되므로 TEM에서 재조합 융합 단백질의 분포를 매핑하는 데 사용할 수있는 산화 오스뮴으로 염색 할 수있다.
2011 년, 슈 등. (10)는 형광 및 448 nm의 푸른 빛으로 흥분 할 때 많은 중항 산소 라디칼을 생성 할 수있는 애기 장대의 flavoprotein에서 파생 된 작은 106 아미노산 융합 태그로 구성 miniSOG 시스템을 발표했다. 그 중항 산소 라디칼에 immunogold 및 표지 항체 (11)보다 상당히 더 가까운 태그 단백질의 표면 근처의 중합체를 형성하기 위해 광을 디아 미노 벤지딘이 산화하는데 사용될 수있다. 플래시 / ReAsH 시스템은 플루오로 데리고가 필요하지만크롬 광을하기 전에 세포에 디아 미노 벤지딘, miniSOG 시스템은 미노와 빛을 필요로하고 추가로 미노를 중합에서 약 두 배의 효과가있다. 여기서, miniSOG는 DNA 복구 병소의 미세 구조를 매핑하기 위해 ESI와 조합하여 사용된다.
DNA 수리 초점 (DRF)
그들은 전좌 및 유전 정보의 손실을 초래할 수 있기 때문에 복구되지 않은 DNA 이중 가닥 나누기는 세포에 심각한 위협을 제기. 차례로,이 노화, 암, 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리에 관여하는 많은 단백질은 12 ~ 14을 깰 DNA 이중 가닥 주위에 조립 초점에 축적. 그 기능이 알려져 있지 않지만, 그들은 DNA 이중 가닥 나누기를 포함하고 DNA 이중 가닥 브레이크 수리의 사이트입니다 핵의 위치를 나타냅니다.
DNA 수리 FOCI (DRF)는 형광 현미경에 의해 특성화되었다 그들은 DNA 손상 12,15위한 바이오 마커로서 작용한다. 그들은 이중 가닥 브레이크의 크기에 대규모 상대적 최근 슈퍼 해상도 현미경 연구는 각각 16 초점 내 분자의 서브 구획화의 증거를 공개 할 때까지 상대적으로 균일 한 고려되었다. 이러한 사이트가 구성되는 방법을 이해하기 위해서는, 서로에 기초 생물학적 구조의 모든 상대적인 시각화하는 것이 필요하다. 이것은 형광 현미경에 의해 달성되지만 전자 현미경 (17, 18)를 통해 가능하다 할 수 없다. 여기서, 방법은 DNA 이중 가닥 브레이크 수리의 미세 구조를 조사하기 위해,이 접근 방식의 조합의 가능성을 설명하기 miniSOG 방법으로 전자 분광 이미징을 결합한 것이 기재되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI는 특별히 인이 풍부 영역을 매핑 할 수 있기 때문에 핵에서 염색질 및 리보의 여러 가지 상태를 조사하기위한 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 이는 근본적으로 전자 현미경에 의해 얻어진 비특이적 대조 방법에 의존하지 수 상세히의 양을 증대시킨다. ESI 하나의 단점은 동일한 가속 전압에서 TEM 종래보다 얇은 부분을 필요로한다는 것이다. 이것은 직렬 섹션 작업 또는 단층 (28)의 방법…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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