Visualisering av miniSOG Märkta DNA Reparations Proteiner i kombination med Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

Gränserna för optisk upplösning och utmaningen att identifiera specifika proteinpopulationer i transmissionselektronmikroskop har varit hinder i cellbiologi. Många fenomen kan inte förklaras genom in vitro-analys i förenklade system och behöver extra strukturell information på plats, i synnerhet i området mellan 1 nm och 0,1 | im, för att till fullo förstås. Här, elektron spektroskopiska avbildning, ett transmissionselektronmikroskop teknik som möjliggör samtidig kartläggning av fördelningen av proteiner och nukleinsyror, och ett uttryck tag, miniSOG, kombineras för att studera struktur och organisation av DNA dubbelsträngsbrott reparation fokus.

Introduction

Trots de betydande framsteg i ljusmikroskop under de senaste åren ^1, cellbiologer lider fortfarande av en lucka i upplösning. Detta begränsar förståelsen av struktur-funktionssamband i fundamentala cellulära processer som involverar en samordnad samspelet mellan makromolekylära komplex (t ex i kromatin remodeling, DNA-reparation, RNA-transkription och DNA-replikation). Även om transmissionselektronmikroskop (TEM) s tillhandahålla den erforderliga upplösningen, har det varit en utmaning att definiera dessa processer strukturellt på grund av oförmågan att märka specifika proteiner och samtidigt kunna bestämma den biokemiska sammansättningen av de visualiserade strukturer. I avsaknad av interna membran för att skilja kärnstrukturer, har kärnan varit särskilt utmanande. Elektron spektroskopisk avbildning (ESI) löser några av dessa begränsningar genom att tillåta samtidig detektion och differentiering av DNA, RNA och protEin-baserade kärnstrukturer ^2-5.

Electron spektroskopisk avbildning:

För att kartlägga elementära fördel med hög känslighet och upplösning i elektronmikroskop, kan man använda en avbildande spektrometer som väljer elektroner som har oelastiskt spridda genom interaktioner med inre skal elektroner på ett element i provet ^6. Eftersom Elementspecifika energimängder förloras som en följd av jonisering av atomerna i provet, kan dessa elektroner separeras och visualiseras med användning av en spektrometer som är fäst till elektronmikroskop. Således, analys av spektrumet av elektroner som har interagerat med provet visar kvalitativ och kvantitativ information om grundämnessammansättningen av provet ^7. Elektroner som inte förlorar energi när tåget passerar genom provet finns i "noll-förlust topp" av energiförlusten elektronspektrum. Överflödet av dessa elektroner är relaterad till massan, densiteten och tjockleken hos provet och består av elektroner som passerar genom provet utan att kollidera med provet eller förlora energi när de passerar genom provstycket. Denna information kan vara användbar för absolut kvantifiering av antalet atomer av en särskild del som föreligger i provet ^8.

Eftersom biologiska prover består till största delen av lätta element som är dåligt avböjer elektronerna i den infallande strålen av TEM, färgningsmetoder med hjälp av heavy metal alter måste tillämpas för att generera kontrasten i provet. Avsaknaden av specificitet hos de flesta av dessa kontrasterande medel och oförmåga att visualisera mer än en fläck där specificiteten är möjligt har begränsat värde på konventionell elektronmikroskopi i studien av kärnan. ESI har betydande fördelar jämfört med konventionell TEM, särskilt för studium av strukturer i cellkärnan.Det är möjligt att utnyttja den fosfor-rika naturen hos DNA- och RNA-innehållande makromolekylära komplex att skilja nukleoprotein komplex från proteinkomplex och att lösa olika nukleoprotein komplex baserat på deras densitet av nukleinsyror. Det återstående biologiskt material kan avbildas baserat på dess överflöd av kväve. Kartläggning just dessa två element och analyser av deras fördelning och relativ förekomst inom olika anatomiska strukturer ger oss en hel del information om kärnan. Till exempel, är det lätt att identifiera kromatin och ribosomerna i kartan som representerar fosfor överflöd. Den interchromatin utrymme, nukleära porer komplex, och kärnorgan, å andra sidan, kan lätt detekteras i kväve kartbild.

Mini singletsyre generatorsystem (miniSOG)

Medan ESI representerar en kraftfull teknik för att studera in situ kromatinstruktur eftersom det tars fördel av de karakteristiska förhållandena i elementär sammansättning mellan fosfor och kväve, grundämnessammansättningen kan normalt inte användas för att skilja mellan olika populationer av proteinkomplex. Antikroppar märkta med små guldpartiklar i nanometerområdet har ofta använts för att kartlägga lokaliseringen av individuella molekyler. Eftersom guldpartikel är vanligtvis fäst till en sekundär antikropp, kommer den att visas inom en omkrets på cirka 20 nm runt epitopen detekteras av den primära antikroppen. I efter inbäddning prover kan antikroppar bara upptäcka epitoper som är exponerade på ytan av sektionerna. Även om det är möjligt att bevisa närvaron av ett antigen och koppla denna till en viss anatomisk struktur hos cellen, den information som erhålls är ofullständig, eftersom de flesta av epitoperna skyms av harts. Pre-inbäddning teknik, som använder liknande protokoll till dem som används för fluorescensmikroskopi, ge tillgång till antigener helahela djupet av provet men Permeabilization åtgärder som krävs för att göra det möjligt för antikroppen att penetrera cellen typiskt kräver avlägsnande av lipidmembran och ta bort komponenter som inte kan fastställas av aldehyder. Dessutom är den föredragna aldehyden fixativ för ultrastrukturen konservering, glutaraldehyd, förstör allmänt epitoper och följaktligen är paraformaldehyd typiskt krävs. Detta är mindre effektiv på protein-proteintvärbindning. En annan nackdel med antikroppar som är märkta med en guldnanopartiklar är att guld är en mycket elektrontätt material som skapar en stark kontrast som kan dölja intressanta konstruktionsdetaljer av provet, som har svagare kontrast.

Framväxten av det grönt fluorescerande protein (GFP) som en uttryckt protein tag har förändrat användningen av fluorescensmikroskopi att svara på frågor i cellbiologi. Märka ett protein med en liten fluorescerande domän tillåter kartläggning av dess fördelning in vivo </em> utan behov av permeabilisering procedurer som kan förändra strukturen. För att översätta eleganta principen att använda protein taggar för att kartlägga proteinfördel i en cell för att elektronmikroskopi, ett system som behövs som kan producera en signal nära strukturen av intresse och skapa kontrast i TEM. Polymeriserad diaminobensidin är en skamfläck som ofta används i histologi för att upptäcka antikroppsbindning. Denna fläck vanligen avsätts med användning av pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerat till en sekundär antikropp. Även om reaktionen ger ett tillförlitligt resultat, är HRP inte katalytiskt aktivt i cytosolen av celler ^9. Reaktionsprodukterna av HRP kan också diffundera bort från platsen för generation så att deras upplösning är värre än nanoguld metoden ^10. För att kringgå dessa problem, var blixten / ReAsH system utvecklat ^11. Den består av rekombinanta fusionsproteiner som uppvisar en tetracysteine ​​motiv. Detta motiv möjliggör bindning aven biarsenic fluorofor. När den exciteras, är den bundna FLASH eller ReAsH kunna generera den mycket reaktiva syre i singlettillstånd och sålunda photoconvert diaminobensidin (DAB) till en polymer som faller ut omedelbart vid stället för de märkta proteinerna. DAB-polymeren kan färgas med osmiumtetroxid, vilket är elektrontätt och kan sålunda användas för att kartlägga fördelningen av det rekombinanta fusionsproteinet i TEM.

Under 2011, Shu et al. ¹⁰ presenterade miniSOG systemet, som består av en liten 106 aminosyror fusion tag härrör från en flavoprotein av Arabidopsis som är fluorescerande och kunna skapa många singsyreradikaler när den exciteras med 448 nm blått ljus. Dessa singlett syreradikaler kan användas för att foto oxidera diaminobensidin för att bilda polymerer på och nära ytan av det märkta proteinet, vilket är avsevärt närmare än immunoguld märkta antikroppar ^11. Medan blixten / ReAsH system kräver att föra fluorkrom och diaminobenzidin in i cellerna innan göra photoconversion det miniSOG systemet kräver bara diaminobensidin och ljus och dessutom är ungefär dubbelt så effektivt på att polymerisera diaminobensidin. Här, är miniSOG används i kombination med ESI för att kartultrastrukturen av DNA-reparations foci.

DNA-reparations fokus (DRF)

Oreparerad DNA-dubbelsträngbrott utgör ett allvarligt hot mot cellen eftersom de kan leda till translokationer och förlust av genetisk information. I sin tur kan detta leda till senescens, cancer och celldöd. Många proteiner som är involverade i DNA-dubbelsträngbrott reparation ackumuleras i fokus som samlas runt en DNA dubbelsträng bryta ^12-14. Även om deras funktion inte är känd, de representerar den plats i kärnan som innehåller den DNA-dubbelsträngbrott och är platsen för DNA-dubbelsträngbrott reparation.

DNA-reparations Foki (DRF) har präglats av fluorescensmikroskopi och de tjänar som biomarkörer för DNA-skada ^12,15. De är enorma i förhållande till storleken på den dubbelsträngbrott och ansågs relativt homogen fram till de senaste super-upplösning mikroskopi studier visade vissa tecken på sub-uppdelning av molekyler inom varje fokus ^16. För att förstå hur dessa platser är organiserade, är det nödvändigt att visualisera alla de underliggande biologiska strukturer i förhållande till varandra. Detta kan inte uppnås genom fluorescensmikroskopi men är möjligt genom elektronmikroskopi ^17,18. Här beskrivs en metod som kombinerar elektron spektroskopisk avbildning med miniSOG metoden för att illustrera möjligheterna med denna kombinerade tillvägagångssättet för att undersöka ultrastrukturen av DNA dubbelsträngbrott reparation.

Protocol

1. Generering av miniSOG cellinjer Grow U2OS (humant osteosarkom) celler i en 35 mm skål innehållande 2 ml låg glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) som kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 atmosfär. Transfektera cellerna när de är 80% sammanflytande genom lipofektion med renat transfektion kvalitet (A269 / 280 förhållandet 1,8-2,0) plasmidkonstruktioner innehåller sekvenserna för miniSOG och mCherry taggade repa…

Representative Results

ESI Jämföra ESI bilder av kärnan (Figur 1) med de konventionella TEM-bilder (t.ex. Figur 7-1) visar en dramatisk ökning av anatomiska strukturer som lätt kan särskiljas. Kromatinet åsar visas i gult och det är ganska lätt att identifiera chromocenters i musceller. Nukleoler kan lätt skiljas från kromatin genom sin runda struktur och olika färg, eftersom de förmonterade ribosomer innehåller redan höga halter av protein…

Discussion

ESI kan fungera som ett utmärkt verktyg för att undersöka olika tillstånd av kromatin och ribonukleoproteiner i kärnan eftersom den kan specifikt kartlägga områden som är rika på fosfor. Det förstärker djupt hur mycket detaljer som kan erhållas genom ett elektronmikroskop och är inte beroende av ospecifika kontrasterande metoder. En nackdel med ESI är att den kräver tunnare sektioner än konventionell TEM vid samma accelererande spänning. Detta kan övervinnas genom att arbeta med seriesnitt eller använ…

Materials

35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	lifetechnologies	16000-044
G418	lifetechnologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan