基于人类腺病毒5型高容量腺病毒载体的克隆及规模化生产

Summary

提出了一种用于生成缺乏所有病毒编码序列的高容量腺病毒载体的方案。载体基因组中包含的转基因的克隆基于归巢核酸内切酶。作为贴壁细胞生长的生产细胞和悬浮细胞中的病毒扩增依赖于在反式细胞中提供病毒基因的辅助病毒。

Abstract

不含所有病毒编码序列的

高容量腺病毒载体 （HCAdV） 因其高包装容量（高达 35 kb）、低免疫原性和低毒性而成为最先进的基因递送载体之一。然而，对于许多实验室来说，HCAdV 的使用受到载体基因组构建和病毒生产复杂程序的阻碍。这里描述了基于含有 HCAdV 基因组的质粒 pAdFTC 高效克隆和生产 HCAdV 的详细方案。HCAdV 基因组的构建基于利用归巢核酸内切酶 （I-CeuI 和 PI-SceI） 的克隆载体系统。任何长达 14 kb 的目标基因都可以亚克隆到穿梭载体 pHM5 中，该载体包含一个侧翼为 I-CeuI 和 PI-SceI 的多克隆位点。在 I-CeuI 和 PI-SceI 介导的转基因从穿梭载体中释放后，转基因可以插入到 HCAdV 克隆载体 pAdFTC 中。由于 pAdFTC 质粒体积大，并且所用酶的识别位点较长，与 DNA 结合较强，因此需要小心处理克隆片段。对于病毒生产，HCAdV 基因组由 NotI 消化释放并转染到稳定表达 Cre 重组酶的基于 HEK293 的生产细胞系中。为了提供用于腺病毒扩增的所有腺病毒基因，需要与包含侧翼 loxP 位点的包装信号的辅助病毒共感染。载体的预扩增在表面生长的生产细胞中进行，载体的大规模扩增在旋转瓶中进行，生产细胞在悬浮液中生长。对于病毒纯化，进行基于氯化铯梯度的两个超速离心步骤，然后进行透析。本文介绍了过去几年使用该 HCAdV 矢量系统开发的提示、技巧和快捷方式。

Introduction

用于基因治疗应用是非常重要的，以避免细胞毒性和免疫原性的副作用引起的病毒蛋白质的表达，转基因本身或者由传入的病毒蛋白。腺病毒载体（腺病毒）被广泛用于将外源DNA成多种细胞的研究转基因表达^1,2的影响。进阶最先进的版本是由高容量腺病毒载体（HCAdV）缺少所有的病毒编码序列^3,4，从而提供包装容量高达35 KB加上低免疫原性和低毒性^5-8来表示。由于其高的包装容量它们允许输送的使用单一载体剂量大或多个转基因。因此，它们代表了研究界的宝贵工具。

在对比第一或第二代腺病毒缺乏早期基因的E1和/或E3，可以使用商业试剂盒可容易地制造，vec的器的基因组结构和病毒产生HCAdV的更为复杂。该系统为HCAdV基因组的结构是基于质粒pAdFTC携带HCAdV基因组缺乏所有病毒编码序列和穿梭质粒pHM5 ^9-12中 。的高达14千碱基（kb的）任何感兴趣的基因可以被克隆到穿梭载体pHM5其中多克隆位点被识别侧翼/裂解归巢内切核酸酶位点PI- SCE我和I- CEU I.因此，感兴趣的克隆的基因可以通过连续的PI-SCE我和I- CEU我被释放消化用于随后定向插入到存在于包含于质粒pAdFTC的HCAdV基因组中的相同限制性位点。在pAdFTC位于PI- SCE I和I-CEU I切割位点之间的转基因....

Protocol

重组HCAdV基因组的构建1.基于所述质粒pAdFTC

注:所有质粒先前已被描述^11,12和可应要求提供。克隆过程在图1中示意性示出。

1. 克隆感兴趣的基因（GOI），包括启动子和聚腺苷酸化信号（pA的）插入穿梭质粒pHM5，使用选择的克隆策略，​​以产生pHM5-GOI。
   注意:由于pAdFTC是一个比较大的质粒，古典质粒制备协议建议，以避免所述质粒DNA的切向通过使用基于二氧化硅膜商业质粒纯化试剂盒。 I-CEU我和PI -Sce我强烈地绑定到DNA，改变消化DNA的电泳迁移率。因此，酚 - 氯仿提取和EtOH沉淀（步骤1.3）的琼脂糖凝胶电泳之前是必需的。
2. 摘要20微克PHM的5-GOI和10 pAdFTC微克由I-CeuI（10U）3小时，在37℃在100微升的总体积来线性质粒（〜2.8kb的+ GOI ORF序列和〜31KB，分别）。
3. 净化用苯酚-氯仿提取，随后乙醇（EtOH）沉淀¹³线性质粒。
   1. 加入100微升酚:氯仿:异戊醇并颠倒管数次​​轻轻混匀。离心机在15000×g下2分钟。
   2. 将上清液转移到新的管中，加入20微升乙酸钠（pH 5，3 M）和400微升冰冷的乙醇（99.8％）和剧烈混合悬浮液。离心机以15,000×g....

Results

示出被用于克隆，扩增和HCAdV制剂的纯化这里代表性实例。克隆策略的通过限制酶消化的概述（ 图1）和用于克隆的代表性例子和HCAdV基因组的释放被提供（ 图2）。从pHM5所述GOI表达盒由PI-SCE I和I-CEU我消化和随后的苯酚-氯仿提取和EtOH沉淀释放后的典型限制图谱（参见步骤1.2- 1.5）所示（图2A）。通常对应于所述pHM5质粒骨架和对应于所述GOI的表达盒的第二频带的〜3kb的频带可以观察到。含有GOI表达盒的带，然后从琼脂糖凝胶纯化。纯化的GOI-表达盒在琼脂糖凝胶上与纯化，脱磷酸化pAdVFTC一起分析使得w作为消化的PI-SCE I和I-CEU我分别（步骤1.7），以验证正确的大小，并估计分子随后连接（图2B）的相对量。结扎后（参见步骤1.8），接着酚-氯仿抽提，乙醇沉淀和SWA我消化，以消除未切割pAdFTC和随后的苯酚.......

Discussion

这里介绍的协议允许根据基于先前描述的方法^4,12人腺病毒5型HCAdV矢量纯化。在pAdFTC质粒内的基因组HCAdV是缺乏所有腺病毒基因和仅携带5'-和3'-的ITR和包装信号。在这一战略的HV AdNG163R-2 ⁴提供了所有必要的基因的高效病毒生产反式 。这提供了一个包装容量高达35 KB，这显然outcompetes第一代和第二代副词或广泛使用的慢病毒（LV） - 或腺相关病毒（AAV）为基础的载体。 HCAdV的特别适用于体内应用的第二个优点是，在相对 ​​于第一或第二代ADVS它们显示细胞毒性水平降低和免疫原性引起的副作用病毒蛋白^5-8的表达这一事实。

然而这里描述的方案是更多的时间和工作密集比其他病毒载体，如LV-或AAV-矢量以及第一或第二代ADVS。一个主要的障碍是大转基因的克隆和随后转移到病毒产生质粒pAdV-FTC。使用归巢核酸内切酶PI-SCE我和I- CEU我提供的穿梭质粒pHM5转基因的精确和定向插入.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	限制性酶
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	限制性酶
T4 连接酶	New Engand Biolabs	M0202S	连接
SwaI	New England Biolabs	R0604S	限制性酶
NotI	New England Biolabs	R0189S	限制性酶切
小牛肠碱性磷酸酶 （CIP）	New England Biolabs	M0290S	消化质粒的去磷酸化
潮霉素 B	PAN Biotech	P02-015	表达 CRE 的 116 细胞的选择
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T 细胞培养基
最低必需培养基 （MEM） Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 细胞培养基
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	PAN Biotech	P04-36500	细胞洗涤，细胞重悬
250 ml 储存瓶	Sigma	CLS430281-24EA	感染在悬浮液中生长的 116 个细胞
500 ml PP 离心管	Sigma	CLS431123-36EA	中细胞的沉降
	Bellco	1965-61030	116 个细胞在悬浮液
超透明超速离心管	贝克曼库尔特	344059	密度梯度离心
超速离心	贝克曼库尔特		密度梯度离心
SW-41 转子	贝克曼库尔特		密度梯度离心
Spectrum Laboratories Spectrapor 膜	VWR	132129	透析管
即用型透析盒	Thermo	66383	透析
单次 DH10B 电转态 E. coli	invitrogen	C4040-52	连接反应转化
PureYield 质粒中提系统	Promega	A2495	中提
peqGOLD 组织 DNA 小量试剂盒	Peqlab	12-3396-02	基因组
DNA SuperFect 转染试剂	分离	116 个细胞
的 Opti MEM （10% FBS）	Gibco	31985-062	转染 116 个细胞
iQ SYBR Green 超混合液	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 触摸	Biorad		qPCR 机器
苯酚/氯仿/异戊醇	Carl Roth	A156.1	纯化 DNA
铯	Carl Roth	8627.1	密度梯度离心
乙酸钠 99%	Carl Roth	6773.2	DNA 沉淀
LB 培养基	Carl Roth	X968.3	细菌生长培养基
乙醇  99.8% 纯度	Carl Roth	9065.5	DNA 沉淀和洗涤
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	裂解  EDTA
	缓冲液 Carl Roth	8043.2	裂解  缓冲液
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	透析缓冲液/裂解  甘油缓冲液
99.5%	Carl Roth	3783.1	透析缓冲液
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	透析缓冲液
NaCl	Carl Roth	3957.1	可选透析缓冲液
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	可选透析缓冲液
蔗糖	Carl Roth	9286.1	可选透析缓冲液
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	可选透析缓冲液
1.5 mL 试管	Sarstedt	72,730,005	病毒制剂在 -80 °C 下储存;丙