En metode til at påføre lukket hoved traumatisk hjerneskade i<em> Drosophila</em

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at påføre lukket hoved traumatisk hjerneskade (TBI) i Drosophila. Denne metode giver en gateway til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for TBI patologier hjælp det enorme opbud af eksperimentelle værktøjer og teknikker til rådighed for fluer.

Abstract

Traumatisk hjerneskade (TBI) påvirker millioner af mennesker hvert år, der forårsager nedsat fysisk, kognitiv og adfærdsmæssige funktioner og død. Undersøgelser under anvendelse af Drosophila har bidraget vigtigste gennembrud i forståelsen neurologiske processer. Således med det mål at forstå den cellulære og molekylære grundlag for TBI patologier hos mennesker, vi udviklede High Impact Trauma (HIT) enhed til at påføre lukket hoved TBI i fluer. Fluer udsættes for HIT enhedens skærm fænotyper i overensstemmelse med human TBI såsom midlertidig uarbejdsdygtighed og progressiv neurodegeneration. HIT enhed anvender et fjederbelastet mekanisme til at drive fluer mod væggen i et hætteglas, der forårsager mekanisk skade på flue hjernen. Indretningen er billig og nem at konstruere, dens drift er enkel og hurtig, og det producerer reproducerbare resultater. Derfor kan HIT enhed kombineres med eksisterende eksperimentelle værktøjer og teknikker til fluer til at løse fundamentalespørgsmål om TBI, der kan føre til udvikling af diagnostik og behandlinger for TBI. Navnlig kan den HIT anordning anvendes til at udføre genetiske skærme omfattende at forstå den genetiske basis for TBI patologier.

Introduction

Traumatisk hjerneskade (TBI) defineres som skade på hjernen fra en ekstern mekanisk kraft. Mest almindeligt, TBI resultater fra lukkede hoved kræfter, såsom stumpe kræfter og inertial acceleration og decelerationskræfter, der forårsager hjernen at ramme indersiden af ​​kraniet. I USA, anslås det, at 50.000 personer dør hvert år af TBI og 2,5-6.500.000 individer lever med konsekvenserne af TBI, herunder invaliderende fysiske, kognitive og adfærdsmæssige problemer ^1,2. Konsekvenserne af TBI er ikke kun på grund af de primære mekaniske skader på hjernen, men også til sekundære cellulære og molekylære skader på hjernen samt andre væv, der opstår over tid ^3-5. Udvikling af de metoder til at diagnosticere og behandle TBI har vist sig at være vanskeligt, fordi TBI er en kompleks sygdom proces. Den variable karakter af primære skader, human fysiologi og miljømæssige faktorer resulterer i heterogene sekundær injuries og patologier. Underliggende variable faktorer indbefatter sværhedsgraden af ​​primær læsion, tiden mellem gentagne primære skader, og alderen og genotype af individet. Forstå, hvordan hver variabel faktor bidrager til konsekvenserne af TBI vil sandsynligvis støtte i udviklingen af metoder til at diagnosticere og behandle TBI ^6,7.

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at påføre lukket hoved TBI i Drosophila melanogaster (bananfluer), der kan anvendes til at afgrænse bidrag variable faktorer til konsekvenserne af TBI. Metoden er baseret på en indledende bemærkning om, at intenst ramme den side af en flue kultur hætteglas mod håndfladen af ​​en hånd forårsagede vildtype fluer at blive midlertidigt uarbejdsdygtig, en sandsynlig konsekvens af TBI. Således har vi bygget High-Impact Trauma (HIT) enhed til at rekapitulere de acceleration og deceleration kræfter fra hånden hårdtslående action. En high-speed film viser, at en enkelt skud fraHIT-enhed forårsager fluer at kontakte hætteglasset væggen flere gange med deres hoved og krop ^8. Til en vis grad, vil sandsynligvis medføre fluen hjernen til Ricochet og deformere mod hovedet kapsel, svarer til, hvad der sker med mennesker i fald og bilulykker ⁹ alle kontakter. Derfor fluer behandles med HIT enhedens skærm fænotyper i overensstemmelse med hjerneskade, herunder midlertidig uarbejdsdygtighed efterfulgt af ataksi, gradvis genopretning af mobilitet, genekspression ændringer i hovedet, og progressiv neurodegeneration i hjernen ^10. Således HIT enhed gør det muligt at undersøge TBI hjælp af enorme arsenal af eksperimentelle værktøjer og teknikker for fluer.

Protocol

1. Konstruktion af HIT Device Fastgør fjederen til bestyrelsen ved hjælp af to klemmer og fire skruer (Figur 1A). Centrer klemmerne i forhold til bredden af ​​bestyrelsen og støde dem op mod hinanden med den ydre klemme flugter med kanten af ​​brættet. Før fastgørelse klemmer, bøje dem ved hjælp af en tang til at passe stramt over foråret. BEMÆRK: Se tabel 1 for beskrivelse af de nødvendige for at konstruere HIT-enheden materialer. Den fastspændt en…

Representative Results

Vi er interesseret i at forstå, hvorfor fluer dør kort efter primær skade. For at kvantificere død, bestemte vi dødelighedsindekset ved 24 timer (MI 24), som er den procentdel af fluer, der døde inden for 24 timer af den primære skade. Fluer udsat for strejker fra HIT enheden blev inkuberet ved 25 ° C i et hætteglas med flue fødevarer, og antallet af døde fluer blev talt efter 24 timer. Vi brugte denne metode til at identificere faktorer, der påvirker MI 24 og fandt, at MI 24…

Discussion

HIT enhed metode adskiller sig fra andre metoder, der påfører traumatisk skade i fluer ved, at det forårsager lukket hoved i stedet gennemtrængende TBI ^11. Endvidere HIT enhedens metode tager mindre tid, kræfter og dygtighed til at påføre TBI i mange fluer, så metoden er mere modtagelig end andre metoder til genetiske skærme store. Endelig er det forhold, at primære tilskadekomne ved HIT enheden ikke er begrænset til hjernen er både en begrænsning og en fordel. Det er en begrænsning, fordi yderl…

Materials

Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 in (length), 15/16 in (outer diameter), 0.12 in (wire size)
Wooden board			9 in (length), 6.5 in (width), 0.75 in (height)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 in (length), 0.68 in (width), 1.11 in (height), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 in (length), (3/4 in width)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 in (length), 9 1/8 in (width), 1 1/4 in (height)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 in (height), 1 1/16 in (inner diameter), 1 1/8 in (outer diameter)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 in (diameter)