En metode å påføre Stengt Leder traumatisk hjerneskade i<em> Drosophila</em

Summary

Her beskriver vi en metode for å påføre lukket hode traumatisk hjerneskade (TBI) i Drosophila. Denne metoden gir en inngangsport til å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer som ligger bak TBI patologi ved hjelp av det store utvalget av eksperimentelle verktøy og teknikker tilgjengelig for fluer.

Abstract

Traumatisk hjerneskade (TBI) rammer millioner av mennesker hvert år, forårsaker nedsatt fysisk, kognitiv og atferdsmessige funksjoner og død. Studier ved hjelp Drosophila har bidratt viktige gjennombrudd i forståelsen nevrologiske prosesser. Dermed, med mål om å forstå den cellulære og molekylære grunnlaget for TBI patologier hos mennesker, har vi utviklet High Impact Trauma (HIT) enheten skal påføre lukket hode TBI i fluer. Fluer utsatt for HIT enhetsvisnings fenotyper i samsvar med menneske TBI som midlertidig uførhet og progressive neurodegenerering. HIT-enheten har et fjærbasert mekanisme for å drive fluer mot veggen i en ampulle, forårsaker mekaniske skader på fly hjernen. Anordningen er billig og enkel å konstruere, sin drift er enkel og hurtig, og det gir reproduserbare resultater. Følgelig kan HIT anordningen kombineres med eksisterende eksperimentelle verktøy og teknikker for å løse grunnleggende fluerspørsmål om TBI som kan føre til utvikling av diagnostikk og behandling for hodeskader. Spesielt kan den HIT anordningen brukes til å utføre store genetiske skjermer for å forstå den genetiske basis av TBI patologier.

Introduction

Traumatisk hjerneskade (TBI) er definert som skade på hjernen fra en ekstern mekanisk kraft. Vanligst, TBI resultater fra lukkede hode krefter som sløv styrker og treghet akselerasjon og retardasjon krefter som forårsaker hjernen til å streike innsiden av skallen. I USA er det anslått at 50.000 mennesker dør hvert år av TBI og 2,5 til 6.500.000 personer lever med konsekvensene av TBI, inkludert ødeleggende fysisk, kognitiv, og problemene atferds ^1,2. Konsekvensene av TBI er ikke bare på grunn av primære mekaniske skader i hjernen, men også til sekundære cellulære og molekylære skader i hjernen, samt andre vev som oppstår over tid ^3-5. Utviklingen av fremgangsmåter for å diagnostisere og behandle TBI har vist seg å være vanskelig fordi TBI er en kompleks sykdom prosess. Den variable natur primære skader, human fysiologi, og miljøfaktorer resulterer i heterogene sekundær jegnjuries og patologi. Underliggende variable faktorer omfatter alvorlighetsgraden av den primære skaden, tiden mellom repeterende primær skader, og alder og genotypen til den enkelte. Forstå hvordan hver variabel faktor bidrar til konsekvensene av TBI er sannsynlig å hjelpe til med utviklingen av metoder for å diagnostisere og behandle TBI ^6,7.

Her beskriver vi en metode for å påføre lukket hode TBI i Drosophila melanogaster (fruktfluer) som kan brukes til å avgrense bidrag av variable faktorer til konsekvensene av TBI. Metoden er basert på en innledende observasjon som intenst treffer siden av en flue kultur hetteglass mot håndflaten av en hånd forårsaket villtype flyr å bli midlertidig uføre, en sannsynlig konsekvens av TBI. Dermed har vi konstruert High-Impact Trauma (HIT) enhet å rekapitulere akselerasjons- og bremsekrefter fra hånden slående handling. En høyhastighets Filmen viser at en enkelt angrep fraHIT-enheten fører flyr til kontakt hetteglasset veggen flere ganger med hodet og kropp ^8. Til en viss grad, alle kontakter vil sannsynligvis føre til at flua hjernen til rikosjetterer og deformere mot hodet kapsel, i likhet med hva som skjer med mennesker i fossen og bilulykker ^9. Følgelig fluer behandlet med HIT enhetsvisnings fenotyper konsistente med hjerneskade, inkludert midlertidig uførhet fulgt av ataksi, gradvis bedring av mobilitet, genuttrykk endringer i hodet, og progressive neurodegenerering i hjernen ^10. Dermed gjør HIT anordningen det mulig å studere TBI bruker enorme arsenal av eksperimentelle verktøy og teknikker som er utviklet for fluer.

Protocol

1. Byggingen av HIT Device Fest våren til styret med to klemmer og fire skruer (Figur 1a). Sentrer klemmene i forhold til bredden på styret og rumpe dem opp mot hverandre med den ytre klemmen i flukt med kanten av brettet. Før du fester klemmene, bøye dem med tang for å passe stramt over våren. MERK: Se tabell 1 for beskrivelser av materialer som kreves for å konstruere HIT enheten. Den fastklemt slutten av våren skal være 1/8 tommer (3,2 mm) fra kanten av bre…

Representative Results

Vi er interessert i å forstå hvorfor fluene dør kort tid etter primær skade. For å kvantifisere død, bestemt vi Dødelighet indeks på 24 timer (MI 24), som er prosentandelen av fluer som døde innen 24 timer av primær skade. Fluer som utsettes for slag fra HIT-enheten ble inkubert ved 25 ° C i et medisinglass med flue mat, og antallet døde fluer ble talt etter 24 timer. Vi brukte denne tilnærmingen til å identifisere faktorer som påvirker MI 24 og fant at MI 24 ikke påvirke…

Discussion

HIT anordning Metoden skiller seg fra andre metoder som påfører traumatisk skade i fluer ved det faktum at den forårsaker lukket hode i stedet for å trenge inn TBI ^11. Videre tar HIT enhet metoden mindre tid, krefter og ferdigheter til å påføre TBI i mange fluer, slik at metoden er mer mottagelig enn andre metoder til store genetiske skjermer. Til slutt, for at primær skader påført av HIT-enheten ikke er begrenset til hjernen er både en begrensning og en fordel. Det er en begrensning fordi flere st…

Materials

Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 in (length), 15/16 in (outer diameter), 0.12 in (wire size)
Wooden board			9 in (length), 6.5 in (width), 0.75 in (height)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 in (length), 0.68 in (width), 1.11 in (height), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 in (length), (3/4 in width)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 in (length), 9 1/8 in (width), 1 1/4 in (height)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 in (height), 1 1/16 in (inner diameter), 1 1/8 in (outer diameter)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 in (diameter)