私たちは、単純化された(アナログ)読み出しで核酸を定量するためのエンドポイントデジタルアッセイについて説明します。液滴ベースのデジタルアッセイのバルク蛍光は、特殊な装置ではなく標準的なqPCR装置を使用して測定し、顕微鏡で結果を確認します。
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この記事について
サマリー
要約
デジタルアッセイは、稀な細胞と個々の核酸分子の計数の検出を可能にする強力な方法です。しかし、デジタルアッセイはまだ日常的に市販されている方法に関連するコストや特定の機器に起因適用されません。ここでは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定するために、従来のリアルタイムPCR機器を使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を提示します。
私たちは、合成液滴の混合物と液滴デジタル複数置換増幅（MDA）アッセイを使用してバルク読み取りアッセイの性能を特徴づけます。デジタル反応形式から定量的なMDAは特に利点が、私たちの新しい方法は、任意のデジタルアッセイに適用されます。デジタルPCRのような確立されたデジタルのアッセイプロトコールについては、この方法は、スピードアップとアッセイ読み取りを単純化するのに役立ちます。
我々のバルク読み出し方法はpartitioneの利点をもたらします専門の読み出し計測を必要とせずにDアッセイ。この規格の要件は、従来のリアルタイム実験のためのより少ない厳しいですがバルク読み出し方法論の主な制限は、液滴カウントプラットフォームおよび標準試料を必要と比べてダイナミックレンジが減少しています。定量的な全ゲノム増幅（WGA）をWGA反応中の汚染物質について試験するために使用され、医薬品の品質管理及び宇宙生物学を含む多様な応用分野における方法大きな期待を与え、未知の配列を有するDNA断片の存在を検出するための最も感度の高い方法です。
概要
核酸定量化（デジタルPCR）1-4とベース順（シークエンシング）のためのデジタルアッセイが強く生命科学や医学に影響を与えています。デジタルアッセイは、高感度を提供する実験全体に容易な比較を可能にし、決定的に、比較可能なデータ5（ 表1）を含む大規模なデータベースの構築を可能にする、絶対的なスケール（対照と比較していない）上の分子数の定量化を提供します。
過去15年間で、全ゲノム増幅（WGA）は、核酸増幅のための一般的なツールとして、PCRと一緒に登場しました。 PCRと同様に、WGAは、容易に検出または塩基配列のようなその後の分析のために使用することができるレベルまでの分のサンプル要素を増幅することによって、分析および分取用途に有用です。 PCRとは異なり、WGAはむしろ未知の配列を含む、サンプル中のすべての配列の増幅を可能に、特定のDNA座に固有のものではありません。PCRとWGAとの間のこの根本的な違いは、互いに相補の方法を行い、そのアプリケーション内の別の課題が生じます。
WGA反応6の高収量は、単一分子7、単セル8および定量またはさらなる分析のために他の低バイオマスサンプル9からのゲノムDNAの日常的な増幅を可能にします。 WGAの化学的性質に関連....
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プロトコル
注意：このプロトコルの液滴は、既存の商業用の液滴メーカー23,29を形成することができるように、マイクロ流体デバイスを製造することは、このアッセイのために必要ではありません。
1.液滴形成マイクロ流体デバイスを作ります
- 以前に31が、液滴発生器のマスクパターン32と概説SU-8マスター製作プロトコルチャネルのためのマスターモールドを準備します。
- ソフトリソグラフィ32,33の技術を使用して、PDMS内のデバイスを製造します。
2.バルク液滴読み出し用の反応ミックスを調製します
注意：このプロトコルは、増幅反応の多くのタイプを使用して、核酸を定量するために使用することができます。一例として、いくつかのラムダDNA濃度のMDAのために必要な試薬が挙げられます。試薬の詳細は特定の試薬の表に記載されています。液滴内のテンプレートの配布はsufficienに依存サンプルのトン混合。
- 取得またはPurifyのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。
- 以前サプライヤーから7、または購入を説明するようにファージPhi29を精製します。示される実験に使用されるフ....
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結果
従来のバルク/リアルタイム読み出し定量PCRおよび定量WGAアッセイ（ 図1）の両方に使用することができるが、デジタル定量的アッセイは、利点がある （表1）を提供します 。記載された方法では、単純なバルクエンドポイント測定（ 図2）を用いて、マイクロ液滴形式のデジタル分析を読み出します。この方法は広く適用可能であるが、この方法は、従来のリアルタイム分析のための特別な課題を提示するので、我々は定量的WGA（MDA）に焦点を当てています。
当社のリアルタイムPCR装置は、油中に分散した蛍光微小液滴の変化分を検出することができるかどうかを確認するために、我々は、蛍光および非蛍光滴（ 図2）の合成混合物の大部分の蛍光を測定しました。バルク蛍光と正の滴数（独立蛍光顕微鏡によって評価）予想通り（蛍光液滴の入力割合で直線的に図3A）。実験は、各セットのために独立した液滴の形成と混合し、3回行いま.......
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ディスカッション
デジタルアッセイは、希少細胞の検出、および核酸分子の個々のカウントを可能にする強力な方法です。しかし、デジタルのアッセイは、まだ日常的に市販されている方法に関連する特殊な装置のコストを部分的には、分析ラボで適用によるものではありません。ここでは、標準的なリアルタイム定量PCR装置を用いて簡略化したアナログ読み出しと核酸を定量するためのエンドポイントのデジタルアッセイを説明します。この方法は、セット・アップするために迅速で、読み出しは、液滴カウント方法よりもはるかに簡単です。
私たちのアッセイは、標準的な機器を使用して一斉エンドポイント測定を簡単にするために、個々の液滴の測定値の単一分子（単一液滴）の感度を失います。当社のデジタルMDAの実験では、蛍光顕微鏡実際FRAによって確認にもかかわらず、バックグラウンドから200の負の液滴あたり1未満の正の液滴を区別することができませんでした（ 図4）予想通り正の液滴のctionでした。バルク蛍光測定限界低い正滴画分の一括測定アッセイの感度の感度と背景。高感度が必要な場合は、デジタル読み出し.......
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開示事項
ブロード研究所は、この研究の側面を含む特許出願を提出するために動く可能性があります。
謝辞
著者は、MDA試薬とプロトコルを提供してくれたLiyi Xuに感謝します。また、この作業に関連する議論をしてくれたDavid Feldman氏とNavpreet Ranu氏にも感謝します。この研究は、Scientific Interface to PCBのBurroughs Wellcome Career Awardによって部分的にサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Evagreen染料 | Biotium | 31000 | |
| ウシ血清アルブミン | ニューイングランド | バイオテクノロジーB9000S | |
| Phi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液 | ニューイングランド | バイオテクノロジーB0269S | 骨材 |
| ラムダDNA | ニューイングランド | バイオテクノロジーN3011S | 50oCに加熱し、急冷希釈前の氷 |
| ランダム化 MDAオリゴ | 統合DNAテクノロジー | 5'-NNNNN*N-3'PCR | |
| プライマー | 統合DNAテクノロジー | 5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3'および5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3' | |
| 超高純度ヌクレアーゼフリー水 | Life Technologies | 10977-015 | Stratalinker 2400 で 30 分間 UV 処理してから使用 (オプション) |
| ROX 参照色素 | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR 光学ストリップキャップ | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR チューブ | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (各 25 マイクロモル) | Agilentテクノロジー | 200415 | |
| サーモサイクラー - Mx3000P qPCR システム | Agilent Technologies | 401403 | |
| バリア ピペットチップ | VWR | 89003-046 | |
| バイオ・ラッド オイル for evagreen | バイオ・ラッド | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
参考文献
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res.
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再版と許可
