Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Massive diafyseale knogledefekter er en stor udfordring for den ortopædiske kirurg. Knogleerstatning med autologt knogletransplantat, der i øjeblikket betragtes som guldstandard behandling, er i begrænset udbud og er forbundet med høst-relateret sygelighed. Af disse grunde har væv-manipuleret knogle konstruktioner kombinerer knoglemarvsceller mesenchymstamceller med osteokonduktive scaffolds blevet udforsket som et alternativ til autotransplantater i ortopædkirurgi.
Til dato har de fleste af de undersøgelser, udført i klinisk relevante dyremodeller såsom hunde, svin og får 1-3, men foreløbig evaluering af disse konstruktioner i ortotopisk, segmentær, kritisk størrelse knogle defekter i små-dyremodeller (ligesom mus) kan have adskillige fordele: (i) lave omkostninger, (ii) et stort antal dyr kan betjenes; (Iii) i modsætning til store dyremodeller, homogenitet musestammer begrænser individuelle variationer i stillads resorption ennd knogledannelse og; (Iv) vigtigst, tilgængeligheden af specifikke antistoffer og gen-målrettede dyr muliggøre evaluering af den biologiske proces involveret i knogleheling. Sidst, men ikke mindst, brug af immundeficiente musestammer muliggør også undersøgelser under anvendelse af enten podninger eller celler af human oprindelse uden negative immunreaktioner i mus.
Trods de førnævnte fordele, massive diafyseale knogler defektmodeller i mus er sparse. De fleste af sådanne modeller bruger knoglefiksering med et intramedullært stift, som fylder knoglemarven hulrum (således begrænser mængden af materiale, der skal testes) og også hæmmer reproducerbarhed ved ikke at give roterende og aksial stabilitet 2,4-7.
Målene for den aktuelle undersøgelse er (i) at efterligne en klinisk knogle ikke-union situation til at beskrive en reproducerbar, kritisk-størrelse, segmentær, femoral defekt model i mus, som er stabiliseret af nøjagtig og reproducerbar låsning-plade osteosynthESIS, der giver en meget stabil biomekanisk miljø 8-10; (Ii) at illustrere den foreliggende model med to potentielle knoglesubstitutter og beskrive knogledannelse analyser, der kan anvendes.
Ektopisk implantation af ortopædiske-relaterede materialer og indretning i mus almindeligvis udføres for at vurdere knogledannende kapacitet af forskellige skeletter 13,14. Vigtige forskelle dog eksistere mellem ektopiske og ortotopisk modeller, herunder indfødte osteogent signalering faktorer og parakrine interaktioner med værten knogledannende celler.
Den foreliggende undersøgelse etablerer en reproducerbar murine stor segmentær, kritisk størrelse femoralis defekt (3,5 mm, ca. 20-25% af lårben længde). I betragtning af størrelsen af en sådan defekt og stabilitet, som den resulterende plade osteosyntese, denne model efterligner den klinisk-stødt atrofisk knogle ikke-union.
Den post-operative periode valgt i nærværende undersøgelse, er i overensstemmelse med tidligere beskrevne ikke-union modeller mus, viser en mangel på tilstrækkelig heling efter 8 til 12 uger 4,9,15,16.
Vigtigst, reproduCIBLE og stabil osteosyntese, samt stabiliteten af de implanterede knoglesubstitutter blev opnået uden signifikant morbiditet og mortalitet 1,2 med anvendelse af både låseplade og en jig at udføre ostectomy. Dette resultat står i kontrast også resultaterne rapporteret når enten en udvendig fikseringsindretning eller et intramedullært søm blev anvendt 4,5,17-24. For de eksterne fikseringsindretninger potentielle ulemper omfatter: variabilitet i stivhed, infektioner af stifterne skrifter, løsning af stifterne, potentialer skader som følge benene og af materialerne (4 til 20% af musenes kropsvægt). For det intramedullære søm potentielle ulemper omfatter: fyldning af medullære kavitet med neglen og iatrogen skade af ledfladerne.
Andre murine segmenter, kritisk størrelse femorale defekter stabiliseret ved plade osteosyntese er blevet beskrevet med knogle defekt skabt af en burre og spænder fra 1,5 til 2 mm længde 16,25. I the foreliggende model, anvendelse af en jig og en savtråd muliggjorde en nøjagtig 3,5 mm langt ostectomy uden væsentlige muskler traumer.
Men for at lykkes i at udføre proceduren bør man tage på betragtning flere vigtige punkter: Brug ikke små mus (Nude mus med enten en vægt under 25 g eller alder under 8 uger) ellers pladen skal være for lang. Når man nærmer sig lårbensknogle, sørge for at bevare både iskiasnerven kaudalt og artikulære kapsel distalt. Påfør pladen på den forreste side af den femorale knogle og da tilpasningen af pladen bestemmes ved anvendelse af dette første skrue, sørge for at placere pladen parallelt til lårbenet ved isætning denne første skrue.
Før det ostectomy, sørge for at udføre en cirkulær dissektion af lårbenet i midten af diafysen at undgå muskulære traumer. Ved udførelse af ostectomy, skal kirurgen assistent holde fast vejledning og surGeon skal passe (i) ikke at tangle savtråden, (ii) at anvende de midterste to tredjedele af tråden, mens anvendelse en konstant jævn spænding, og (iii) for at undgå overskydende bevægelse for at opnå en lige knogle snit.
Knogleheling er muligt i den foreliggende model billede anvendes en knogletransplantation. Desuden denne model giver mulighed for yderligere undersøgelser af de involverede i knogler udskiftning strategier mekanismer, når enten menneske-oprindelse podninger eller celler anvendes i et godt standardiseret, store, segmentær, knogledefekt.
Endvidere i overensstemmelse med den nuværende udvikling kræver forbedring og reducering af anvendelse af dyr i ortopædi-relateret forskning, denne model kan anvendes sammen med in vivo billedteknik såsom bioluminescens. Sådanne ikke-invasive teknikker tillader overvågning både implanteret celleoverlevelse og væv healing uden at kræve dyr offer 26.
Store begrænsninger for den foreliggende model er både denbærende betingelser og mængden af knogledefekten skabes, fordi de ikke fuldt ud efterligne dem, der optræder klinisk hos mennesker. Andre begrænsninger af modellen, er (i) radio-opaciteten af pladen, som kan kræve fjernelse af pladen før ex vivo μCT analyse og kan komplicere fortolkningen af de langsgående radiografiske undersøgelsesresultater, og (ii) den manglende evne til at modulere plade stivhed som kan være en vigtig mekanisk parameter i knogledannelse 27-30.
Man skal huske på også, ved brug af enten knogle isotransplantat eller andre stilladser indeholder en mineralsk komponent (specifikt calciumcarbonat), at en vis skævhed introduceres i segmentering processen med mikro-CT-analyse, fordi nydannede knogletæthed delvist overlappede med enten isotransplantat densitet eller stillads densitet. Af denne grund knoglevolumen opnå ved mikro-CT analyse meste afspejler mængden af mineraliseret væv (nydannet knogle plusknogle erstatning) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Rena Bizios for hendes værdifulde kommentarer til manuskriptet.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |