A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.
Uden en aktiv, blomstrende cellepopulation, der er godt fordelt og stabilt forankret til det indsatte skabelon, er usædvanlig knogleregenerering ikke forekomme. Med konventionelle skabeloner, fravær af interne mikrokanaler resulterer i manglende celleinfiltration, distribution og inhabitance dybt inde skabelonerne. Derfor, en meget porøs og ensartet sammenkoblede trabekulære-bone-lignende skabelon med mikrokanaler (biogene mikromiljø skabelon; BMT) er blevet udviklet til at behandle disse hindringer. Romanen BMT blev skabt af innovative koncepter (kapillarvirkning) og fremstillet med en svamp-skabelon belægning teknik. Den BMT består af flere strukturelle komponenter: indbyrdes forbundne primære-porer (300-400 um), der efterligner porer i knogletrabecula, mikro-kanaler (25-70 um) inden for hver trabecula og nanopores (100-400 nm) på overflade for at tillade celler at forankre. Desuden har BMT blevet dokumenteret ved mekanisk test undersøgelse at have simma- mekaniske styrkeegenskaber til dem i human trabekulær knogle (~ 3.8 MPa) 12.
Den BMT udstillede høj absorption, fastholdelse og beboelse af celler i hele bro-formede (n) skabeloner (3 cm højde og 4 cm længde). De celler, der oprindeligt var podet i den ene ende af skabelonerne mobiliseres omgående til den anden ende (10 cm afstand) ved kapillarvirkning af BMT på cellen medier. Efter 4 timer, cellerne homogent besatte hele BMT og udviste normal cellulær adfærd. Den kapillarvirkning tegnede sig for infiltration af cellerne suspenderet i medierne og distribution (aktiv migration) i hele BMT. Efter at have observeret disse kapaciteter af BMT, forventer vi, at BMTs vil absorbere knoglemarvsceller, vækstfaktorer og næringsstoffer fra periferien under fysiologiske betingelser.
Den BMT kan løse nuværende begrænsninger via hurtig infiltration, homogen fordeling og inhabitance af celler i store, volumetriske skabeloner til at reparere massive skeletdefekter.
The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5.
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration.
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few µm to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.
En multikomponent skabelon herunder celler, vækstfaktorer, næringsstoffer osv er nødvendig for en vellykket knogleregeneration og funktionelle genoprettelse af kritiske størrelse store knogledefekter. Inden for disse faktorer, anatomisk overensstemmende biologiske egenskaber er afgørende. For at opnå biologisk funktionalitet, skal skabelonen udvise biokompatibilitet, osteokonduktivitet, mekaniske integritet, et areal, en tilstrækkelig overflade tekstur, og midlerne til ilt og næringsstoffer transport. På celleniveau, følgende funktioner er særligt afgørende for funktionel genopretning af massive knogledefekter: lettet indtrængen i skabelonen (aktiv rekruttering), ensartet fordeling i hele skabelonen (fastholdelse), accelereret proliferation og høj levedygtighed (beboelse). Endelig den efterfølgende dannelse af betydelige ekstra cellulær matrix og udløsning af genekspression er afgørende for fundamentale biologiske processer, såsom hurtig vaskularisering ennd osteogenese.
Mange forskellige typer af syntetiske erstatninger er blevet foreslået at erstatte auto- / tildelinger knogletransplantater. Men den nuværende stillads organisationen ikke udviser en intern mikromiljø indeholder mikro-kanaler og nano-porer, og derfor ikke aktivt fremmer celle infiltration, distribution og inhabitance dybt ind de syntetiske substitutter, der er større end 10 mm. De giver ikke fysiske signaler til banebrydende celler til effektivt, hurtigt og ensartet vandrer dybt i knoglen skabelonen. I stedet, den begrænsede passive rekruttering af celler skaber en ulige fordelt cellepopulationer mellem de ydre og indre områder af stilladset. Dette forværrer ikke kun den indledende udfordring i de celler der strækker den indre kerne af skabelonen, men hindrer også næringsstoffer flow og celle kommunikation med den anden ende af det syntetiske stedfortræder. Denne type af uforholdsmæssig celle rekruttering og inhabitation resulterer i celle death og ufuldstændig knoglevækst efter stilladset er implanteret i kroppen 14,15.
Således har vi indført begrebet kapillarvirkningen som den primære fysiske cue til at løse disse hindringer. Vi har grundigt manipuleret mikro-kanaler i BMT at inducere kapillær handling, der vil tegne sig for den primære trække kraft ansvarligt for aktivt at rekruttere celler dybt ind i BMT.
PU svamp coating teknik viser en række unikke egenskaber. For det første giver mulighed for en nem tilberedning af velkontrollerede porøse trabekulære strukturer, som selv afhænger af de foruddefinerede skabelon strukturer (dvs. 80 pore per tomme skabelon til 300-400 um). Dette er meget vigtigt for at optimere porestørrelse for osteoblast infiltration 15. For det andet, den teknik muliggør konstruktionen af indbyrdes forbundne mikro-kanaler, der tegner sig for den betydelige rolle initialisering celle udflytning 11. For det tredje, er der næsten ingen begrænsninger, når du bruger PU svamp i form af oprettelse af brugerdefinerede former og størrelser af skabelonerne. Maker kan bruge en saks til simple former eller endda beregnet laserskæring for komplekse geometrier. Ved hjælp af disse præcist kontrollerede teknologier, vi skabte BMT. HA blev valgt som udgangsmateriale på grund af dets biokompatibilitet og osteokonduktive kapacitet 17.
I denne undersøgelse er der flere vigtige skridt, der skal fremhæves. Under HA slemmeriet, hvis temperaturen er for høj, og omrøringshastigheden er for lav, vil HA opslæmningen sætte sig fast på bundkanterne af bægerglasset og tør op. Efter coatingprocessen når blæser ud af det overskydende HA opslæmning, kan for høj en lufttryk inducere revner på overfladen af BMT. Det er vigtigt at holde lufttrykket relativt lav til korrekt luft ud overskydende HA opslæmning alene. Endelig det andet og tredje trin i sintringsprocessener mest afgørende (Heat 1 ° C / min, indtil 280 ° C og opvarmes 0,5 ° C / min, indtil 400 ° C). I dette temperaturområde vil PU svamp helt brænde ud, mens HA bliver tæt. Hvis denne protokol ikke er fulgt nøje, vil BMT blive kollapsede eller smuldret efter sintring.
Beskrevet i denne undersøgelse BMT giver flere fordele. Først de indbyrdes forbundne makro-porer (300-400 um) efterligner dem af menneskelig trabekulære knogle og giver mulighed for jævn knoglemarv flow. For det andet, er skabelonerne består af mikro-kanaler (25-50 um) inden for hver trabekulære septum at fremskynde den oprindelige indtrængning af knogleceller via kapillarvirkning. Som påvist ved hjælp af computersimuleringer 13, hvis skabelonen kun havde 300 um porer (primær porer), og ingen mikrokanaler, ville være utilstrækkelig til fuldstændig mætning af skabelonen med knoglemarv kapillarvirkning. Dette vil især være tilfældet for store størrelse defekter, der ville kræve large størrelse skabeloner. Mikrometer størrelse kanaler udviser flydende absorption yderst effektiv, og forventes således vi mikrokanalerne at være hovedansvarlig for kapillarvirkningen i vores undersøgelse. For det tredje har vores BMTs strategisk placeret nano-porer. Data fra litteraturen indikerer, at celler er særligt følsomme over for nano-mønstre 18,19; derfor forventede vi nano-porerne på væggene i mikrokanalerne at spille en rolle ved at øge cellebinding. Nanostørrelse porer (100-400 nm) på overfladen af det trabekulære septa tilladt immobiliserede celler til anker. Samlet set den kombinerede effekt af disse tre interne strukturer resulterede i øget celle mobilisering og vedhæftning i hele skabelonen. Der er dog nogle begrænsninger i protokollen og de kritiske trin at fremstille perfekte BMT. For eksempel er der ofte en stor mængde af HA opslæmning fremstillet på grund af vanskeligheden ved at bevare en homogen viskositet, mens coating. Der er også en begrænsning i at gøreskabeloner større end 5 cm 3 i volumen på grund af arbejdstiden, mens belægning. Belægningen tykkelse er kritisk, som varierer afhængigt Maker'ens teknikker.
Resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at BMT i stand til at absorbere og tilbageholde celler vil tilbyde potentielle fordele i forhold til konventionelle alloplastic (eller syntetiske) stilladser. En prospektiv undersøgelse overvejes at kontrollere fordelene ved BMT på osteogenese og / eller angiogenese sammen med knogle-relaterede vækstfaktorer. Derfor er vi hævder, at vores unikke featured BMT stillads kan tage fat på de store barrierer af utilstrækkelig knoglemarv infiltration i de syntetiske konstruktioner og ufuldstændig knogle regeneration i store defekter.
Det endelige mål med denne undersøgelse er at forenkle den nuværende paradigme bioteknologi i knoglerekonstruktion og funktionel genopretning i kritisk størrelse knoklede defekter ved at eliminere behovet for tids- / arbejdskrævende knoglemarvsstromaL-celler isolation og ekspansion processer. Endelig ønsker vi at udnytte anatomisk overensstemmende 3D-konstruktioner med mikro-kanaler og nano-porer, som inducerer hurtig celle absorption, homogen fordeling, og inhabitance til rekonstruktion af knogle.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
Polyvinyl Alcoho | Sigma-Aldrich | 341584 | |
Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |