ل<em> في المختبر</em> نموذج لقياس الاستجابات المناعية لمكافحة الملاريا في سياق الفيروس المسبب للإيدز
Summary
Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.
Abstract
Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood.
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility.
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.
Introduction
شارك العدوى، عدوى الالتهابات المتزامنة متعددة، هو القاعدة في البيئات الطبيعية. شارك في العدوى يمكن أن يكون لها تأثير كبير على علم الأمراض، وعلى التدبير العلاجي السريري لكل العدوى. في سياق التعاون العدوى، لقاح ونجاعة الأدوية، وكذلك الاختبارات التشخيصية، ويمكن أن يتأثر سلبا (إعادة النظر في 1). ومع ذلك، على الرغم من أهميته، فإن غالبية الأبحاث الممرض تعتبر التهابات واحدة فقط.
الملاريا وHIV-1 (HIV) هي الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات على مستوى العالم. مناطق توطن الملاريا وفيروس نقص المناعة البشرية تشترك في تداخل جغرافي واسع، ووضع الملايين من الأشخاص المعرضين لخطر الاصابات المشتركة، وبالتالي لخطر المرض السريري أكثر شدة 2-10. هذين المرضين تتفاعل سلبا. في الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وارتفاع الأحمال الفيروسية فيروس نقص المناعة البشرية والانخفاضات المؤقتة في CD4 + T التهم الخلايا يمكن أن ينظر إليها خلال عدوى الملاريا، في حينالملاريا طفيلي أعباء ومخاطر الملاريا السريرية وشديد أعلى في المصابين شارك أفراد 2،3،5،7،8،10. الآليات التي يزيد فيروس نقص المناعة البشرية شدة الملاريا ليست مفهومة تماما وتبرر اجراء مزيد من التحقيقات.
نحن هنا وصف الطريقة التي الملاريا وشارك في الإصابة بفيروس نقص المناعة يمكن دراستها في المختبر وعلى وجه التحديد، ويسمح هذا الأسلوب لفحص ردود الملاريا محددة المناعية في سياق الإصابة بالفيروس. يصف بروتوكول لدينا نظام متعدد الاستعمالات شارك في الثقافة باستخدام خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية المعزولة حديثا (PBMCs) معزولة عن مزمنة بفيروس نقص المناعة البشرية المانحين المصابة في المختبر مثقف P. مطفول المنجلية كريات الدم الحمراء (PfRBC). ويمكن أيضا أن تدرس تأثير العلاج المضاد للفيروس نقص المناعة البشرية على هذه الردود باستخدام PBMCs جمعت بأثر رجعي من فيروس نقص المناعة البشرية (+) الجهات المانحة قبل وبعد العلاج.
وقد استخدمنا هذا النظام للتحقيق في تأثير فيروس نقص المناعة البشريةعلى الاستجابات المناعية الفطرية الملاريا محددة 11،12، وتمكنوا من تحديد أن IFNγ وTNF الردود الملاريا محددة يعانون من ضعف في الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا NKT، γδ الخلايا التائية من فيروس نقص المناعة البشرية (+) الجهات المانحة قبل وبعد العلاج المضاد للفيروس نقص المناعة البشرية . بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على استخدام هذا النظام لتحديد أن ظائف الوحيدات يتم تخفيض قيمة أيضا في فيروس نقص المناعة البشرية (+) الجهات المانحة، ولكن التعافي بعد فيروس نقص المناعة البشرية العلاج المضاد للفيروسات الرجعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تحسين بروتوكول لدينا من أجل دراسة أكثر واقعية المشارك العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية الملاريا في المختبر. أولا، يتعين على كرات الدم الحمراء البشرية الطازجة ومصل للثقافة طفيلي الملاريا. وهذا أمر حيوي للحصول على صحة السكان من طفيليات الملاريا. لست] الطف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.A.M.F. and L.S. participated in protocol design, acquisition and analysis of data, and drafting of the article.
The authors wish to thank Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth, and Dr. Ayi for their contributions.
C.F. was supported by a CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN) postdoctoral fellowship. L.S. is supported by an OHTN Junior Investigator Development Award. The present work was supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) operating grant (MOP-13721 and 115160), and a CIHR New Investigator Catalyst grant.
Materials
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
