We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.
The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.
इस तरह के मस्तिष्क vasospasm 1,2, उच्च रक्तचाप 3, और atherosclerosis 4, के रूप में वाहिका रोगों, धीरे-धीरे विकसित प्रकृति में आम तौर पर पुरानी हैं, और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) द्वारा बेकार बल पीढ़ी को शामिल करना। हम में इन विवो मॉडल की तुलना में प्रयोगात्मक शर्तों के बेहतर नियंत्रण के साथ इन विट्रो तरीकों में उपयोग करते हुए इन धीमी गति से प्रगति कर संवहनी रोग का अध्ययन करना है। इन विट्रो के कार्यात्मक सिकुड़ना को मापने के लिए हम पहले से विकसित किया है संवहनी पेशी पतली फिल्मों (vMTFs) हृदय के ऊतकों 5 इंजीनियर, लेकिन इस विधि अपेक्षाकृत कम अवधि के अध्ययन तक ही सीमित कर दिया गया है। यहाँ, हम लंबी अवधि के मापन के लिए हमारे पिछले vMTF तकनीक फैलता है कि एक सब्सट्रेट संशोधन तकनीक मौजूद है।
अन्तःचूचुक समग्र नाड़ी समारोह में भी महत्वपूर्ण है, इंजीनियर धमनी लामेल्ले नाड़ी में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली प्रदानरोग प्रगति दौरान सिकुड़ना। एक कार्यात्मक रोग ऊतक मॉडल, संरचना और धमनी लामेल्ला के समारोह में दोनों इंजीनियर को, जहाज के बुनियादी सिकुड़ा इकाई, उच्च निष्ठा के साथ recapitulated किया जाना चाहिए। धमनी लामेल्ले 6 elastin के पत्रक द्वारा अलग सिकुड़ा VSMCs का गाढ़ा, circumferentially गठबंधन चादरें हैं। Polydimethylsiloxane (PDMS) substrates पर बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन की microcontact मुद्रण पहले से हृदय के ऊतकों 5,7-10 गठबंधन की नकल करने के ऊतक संगठन के लिए मार्गदर्शन cues प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, ऊतकों पुरानी पढ़ाई में उनके प्रयोज्यता सीमित संस्कृति में 3-4 दिनों के बाद अखंडता खो सकते हैं microcontact मुद्रण का उपयोग कर नमूनों। इस प्रोटोकॉल एक नया microfluidic के बयान तकनीक के साथ पिछले microcontact मुद्रण तकनीक की जगह से इस मुद्दे का समाधान प्रदान करता है।
Genipin और च के साथ Genchi एट अल। संशोधित PDMS substrates केound संस्कृति 11 में एक महीने के लिए myocytes की व्यवहार्यता अप लंबे समय तक। यहाँ, हम PDMS पर नमूनों संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की संस्कृति का विस्तार करने के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करें। Genipin, गार्डेनिया फल का एक प्राकृतिक hydrolytic व्युत्पन्न, इसी तरह crosslinking एजेंट और ऊतकों की मरम्मत 12,13 और ईसीएम संशोधन 14 के क्षेत्र में एक biomaterial के रूप में इसके बढ़ते उपयोग की तुलना में इसकी वजह से अपेक्षाकृत कम विषाक्तता के लिए सब्सट्रेट संशोधन के लिए एक वांछनीय उम्मीदवार है 15। इस प्रोटोकॉल में, फ़ाइब्रोनेक्टिन पिछले microcontact मुद्रण विधियों के रूप में, एक सेल मार्गदर्शन के संकेत के रूप में उपयोग किया जाता है; हालांकि, genipin फ़ाइब्रोनेक्टिन patterning के लिए पूर्व PDMS substrates पर जमा किया जाता है। कोशिकाओं के नमूनों मैट्रिक्स नीचा के रूप में इस प्रकार, संलग्न VSMCs से नए संश्लेषित ईसीएम genipin लेपित PDMS सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य कर सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल दो कदम genipin और ईसीएम बयान के लिए एक microfluidic वितरण डिवाइस का इस्तेमाल करता है। microfluidic युक्ति mimics microco के डिजाइनपिछले अध्ययनों में 16 इंजीनियर धमनी lamellae के लिए इस्तेमाल किया ntact मुद्रण पैटर्न। इस प्रकार, हम इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विवो संरचना और धमनी lamellae के सिकुड़ा समारोह में अत्यधिक गठबंधन पुनरावृत्ति कि धमनी लामेल्ले mimics उपज की उम्मीद है। हम यह भी है कि genipin इन विट्रो रोग मॉडल में लंबी अवधि के लिए एक उपयुक्त सब्सट्रेट संशोधन यौगिक है पुष्टि करने के लिए ऊतक सिकुड़ना का मूल्यांकन।
यहाँ, हम जीर्ण रोग रास्ते 1,23,24 की विस्तारित प्रयोग गुना अधिक विशिष्ट, की अनुमति पहले से विकसित vMTF प्रौद्योगिकी पर बनाता है कि एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह पूरा करने के लिए हम पहले से MTF सिकुड़ना प्रयोग?…
The authors have nothing to disclose.
We acknowledge financial support from the American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) and the University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). We also acknowledge the microfabrication resources of the Minnesota Nano Center (MNC) and the image processing resources of the University Imaging Centers (UIC), both at the University of Minnesota. Parts of this work were carried out in the Characterization Facility, University of Minnesota, which receives partial support from NSF through the MRS program.
Coverslip staining rack | Electron Microscopy Sciences | www.emsdiasum.com/ | 72239-04 | Alternative coverslip rack may be used |
Microscope cover glass – 25 mm | Fisher Scientific, Inc. | www.fishersci.com | 12-545-102 | Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base |
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | #21458 | Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation |
1-butanol | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | 360465 | Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used |
Spincoater | Specialty Coating Systems, Inc. | www.scscoatings.com | SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Alternative distributor may be used |
Fluorescent microbeads | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | 17151 | Alternative brand and/or larger size may be used |
Silicon wafers | Wafer World, Inc. | www.waferworld.com | 2398 | Alternative brand and/or size may be used |
Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height | |
Contact mask aligner | Suss MicroTec | www.suss.com | MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure | |
Developer | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 Developer; Hazard: flammable | |
Tridecafluro-trichlorosilane | UCT Specialties, Inc. | www.unitedchem.com | T2492 | Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. ) |
Surgical biopsy punch | Integra LifeSciences Corp. | www.miltex.com | 33-31AA-P/25 | Alternative brand and/or size may be used |
Genipin | Cayman Chemical | www.caymanchem.com | 10010622 | Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
1X phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | www.cellgro.com | 21-031-CV | Alternative brand may be used |
Fibronectin | Corning, Inc. | www.corning.com | 356008 | Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Inc. | www.lifetechnologies.com | 15140-122 | Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same |
Umbillical artery smooth muscle cells | Lonza | www.lonza.com | CC-2579 | Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly |
Tyrode's solution components | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | various | Alternative brand may be used for mixing solution |
Stereomicroscope | Zeiss | www.zeiss.com | 4350020000000000 | SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used |
Temperature-controlled platform | Warner Instruments | www.warneronline.com | 641659; 640352; 641922 | |
Endothelin-1 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | E7764-50UG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |
HA-1077 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | H139-10MG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |