We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Рецептор-лиганд Мембранные опосредуют многие клеточные функции. Переплет кинетика и вниз по течению сигнализации вызвано этих молекулярных взаимодействий, вероятно, зависит от механической среды, в которой обязательными и сигнализации состоится. Недавнее исследование показало, что механическая сила может регулировать признание антигена и запуск Т-клеточного рецептора (TCR). Это стало возможным благодаря новой технологии мы разработали и называется флуоресценции зонда биомембрана силы (fBFP), который сочетает в себе одной молекулы силовой спектроскопии с флуоресцентной микроскопии. Использование ультра-мягкой эритроцит человека как чувствительный датчик силы, высокоскоростной камеры и в режиме реального времени методы отслеживания изображения, fBFP имеет ~ 1 PN (10 -12 Н), ~ 3 нм и ~ 0,5 мсек сила, пространственное и временное разрешение. С fBFP, можно точно измерить отдельные рецептор-лиганд кинетики связывания под регулирования силы и одновременно изображение связывание-срабатывает внутриклеточный калбилирубина сигнализации на одном живой клетке. Эта новая технология может быть использована для изучения другой рецептор-лиганд и мембраны сигналов в других ячейках, при механическом регулировании.
Клетка-клетка и клетка-к-внеклеточного матрикса (ЕСМ) адгезия опосредуется связыванием между рецепторами клеточной поверхности, ECM белков, и / или липидов 1. Связывание позволяет клеткам с образованием функциональных структур 1, а также признать, общаться и реагировать на окружающую среду 1-3. В отличие растворимых белков (например, цитокины и факторы роста), которые связывают с трехмерной (3D) жидкой фазы на рецепторы клеточной поверхности, адгезии клеток рецепторы образовывать связи с их лигандами через узкий зазор соединительного по преодолению две противоположные поверхности, которые ограничивают молекулярную диффузии в размерном интерфейса 4-7 двух (2D). В отличие от 3D кинетики, которые обычно измеряется с помощью традиционных анализов связывания (например, поверхностного плазмонного резонанса или SPR), 2D кинетики должны быть количественно специализированных методов, таких как атомно-силовой микроскопии (АСМ) 8-10 камеру 11,12 течь, микропипетка 13,14, оптическийпинцет 15 и биомембрана силы зонд (ДЦ) 16-21.
Больше, чем просто обеспечение физической связи для сотовых сплоченности, молекулы адгезии являются основным компонентом техники сигнализации для ячейки, чтобы общаться с его окружением. Там было все больший интерес в понимании того, как лиганд взаимодействие молекул адгезии инициирует внутриклеточную передачу сигнала и, как начальный сигнал трансдуцированных внутри клетки. Интуитивно, свойства рецептор-лиганд связывания может повлиять сигналы, которые он индуцирует. Тем не менее, трудно анализировать механистические отношения между внеклеточной взаимодействия и внутриклеточных сигнальных событий с использованием традиционного ансамбль биохимических анализов из-за своих многочисленных ограничений, например, бедной временным разрешением и полным отсутствием пространственным разрешением. Существующие методы, которые позволяют как биофизический (2D рецептор-лиганд кинетики связывания) и биохимические (сигнализации) замечания по живойклетки включают субстраты перестраиваемой жесткости 22, резина столба массивов 23 и проточная камера / микрожидкостных устройства включены с флуоресцентной способности 24-26. Тем не менее, показания сигнализации и рецептор-лиганд связывания должны быть получены отдельно (чаще различными методами), что делает его трудно анализировать временные и пространственные соотношения характеристик связь с сигнальных событий.
Обычные ДЦ является сверхчувствительного силовая спектроскопия с высоким пространственно-временным разрешением 17. Он использует гибкую эритроцит (РБК) в качестве датчика силы, что позволяет измерять одной молекулы 2D кинетики, механических свойств и конформационных изменений 14,16,19-21,27-29. На основе люминесцентных изображений ДЦ (fBFP) коррелирует рецептор-лиганд кинетики связывания с обязательной-клеточной сигнализации срабатывает при масштабе одной молекулы. С этой установкой, деятельности сигнальных Ситу клеток в в контексте поверхностных mechaniкал стимуляции наблюдалось в Т-клетках 27. FBFP является универсальным и может быть использован для изучения адгезии и клеточной сигнализации, опосредованные другими молекулами в других клетках.
Успешный эксперимент fBFP влечет за собой несколько важных соображений. Во-первых, для расчета силы, чтобы быть надежным, микропипетка, РБК, и зонд шарик должен быть выровнен как можно ближе к коаксиальному как это возможно. Проекция RBC внутри пипетки должны быть примерно одного диаметра ?…
The authors have nothing to disclose.
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Table 1: Reagents/Equipment | |||
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
Table 2: Buffer solutions | |||
Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
Sucrose | 9.70g/L |