We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Membran receptor-ligand interaktioner medierar många cellulära funktioner. Bindande kinetik och nedströms signalering utlöses av dessa molekylära interaktioner sannolikt påverkas av den mekaniska miljö där bindning och signalering sker. En ny studie har visat att mekanisk kraft kan reglera antigenigenkänning genom och triggning av T-cellreceptorn (TCR). Detta har möjliggjorts genom en ny teknik vi utvecklat och benämnd fluorescens biomembran kraft sond (fBFP), som kombinerar enda molekyl kraft spektroskopi med fluorescensmikroskopi. Använda en ultramjuk människa röda blodkroppar som den känsliga kraftsensor, en höghastighetskamera och realtids imaging spårningsteknik, är ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 nm fBFP och ~ 0,5 msek i kraft, spatial och temporal upplösning. Med fBFP, kan man exakt mäta enskilda receptor-ligandbindande kinetik enligt gällande lagstiftning och samtidigt bildbindnings utlöst intracellulär kalcium signalering på en enda levande cell. Denna nya teknik kan användas för att studera andra membranreceptor-ligand-interaktion och signalering i andra celler under mekanisk reglering.
Cell-till-cell och cell-till-extracellulära matrix (ECM) vidhäftning medieras genom bindning mellan cellytereceptorer, ECM-proteiner och / eller lipider 1. Bindning tillåter celler att bilda funktionella strukturer 1, såväl som att känna igen, kommunicera, och reagera på miljön 1-3. Till skillnad från lösliga proteiner (t.ex. cytokiner och tillväxtfaktorer) som binder från ett tredimensionellt (3D) fluidumfas på cellytereceptorer, celladhesionsreceptorer bilda bindningar med sina ligander över en smal Junktional gap att överbrygga två motstående ytor som begränsar molekyl diffusion i en tvådimensionell (2D) gränssnitt 4-7. I motsats till 3D kinetik som vanligen mätas med traditionella bindningsanalyser (t.ex. ytplasmonresonans eller SPR), 2D kinetik måste kvantifieras med specialiserade tekniker såsom atomkraftsmikroskopi (AFM) 8-10, flödeskammare 11,12, mikropipett 13,14, optiskpincett 15 och biomembran kraft sond (BFP) 16-21.
Mer än bara ge fysisk koppling för cellulär sammanhållning, adhesionsmolekyler är en viktig del av maskinen signalering för cellen att kommunicera med sin omgivning. Det har funnits ett ökande intresse för att förstå hur ligandengagemanget av adhesionsmolekyler initierar intracellulär signalering och hur den initiala signalen transduceras inuti cellen. Intuitivt, egenskaper hos receptor-ligandbindning kan påverka de signaler det inducerar. Det är dock svårt att dissekera mekanistiska relationer mellan den extracellulära interaktion och intracellulära signaleringshändelser med traditionell ensemble av biokemiska analyser på grund av sina många begränsningar, till exempel, en dålig tidsupplösning och den fullständiga bristen på rumslig upplösning. Befintliga metoder som gör att både biofysiska (2D-receptor-ligandbindande kinetik) och biokemiska (signalering) synpunkter på levandeceller innefattar substrat av avstämbara styvhet 22 elastomer pelaren matriser 23 och flödeskammare / mikrofluidikanordningar införlivas med fluorescens kapacitet 24-26. Men avläsning av signalering och receptor-ligandbindning måste erhållas separat (oftast genom olika metoder), vilket gör det svårt att dissekera temporala och rumsliga relationer obligations egenskaper med signaleringshändelser.
Konventionell BFP är en ultra kraft spektroskopi med hög Spatiotemporal upplösning 17. Den använder en flexibel röda blodkroppar (RBC) som en kraftsensor, som möjliggör mätning av enda molekyl 2D kinetik, mekaniska egenskaper och konformationsförändringar 14,16,19-21,27-29. En fluorescerande avbildning baserad BFP (fBFP) korrelerar receptor-ligandbindande kinetik med bindnings utlöst cellsignalering vid enda molekyl skala. Med denna inställning, in situ cellsignalering aktiviteter i samband med ytan mekanismer ochcal stimulering observerades i T-celler 27. Den fBFP är mångsidig och kan användas för studier av cellvidhäftning och signalering medieras av andra molekyler i andra celler.
En framgångsrik fBFP experiment innebär några kritiska synpunkter. Först för kraftberäkning vara tillförlitliga, mikropipett, RBC, och sonden pärla bör anpassas så nära till koaxial som möjligt. Projektionen av RBC inuti pipetten bör vara ca en sond pipett diameter, så att friktionen mellan RBC och pipetten är försumbar. För en typisk mänsklig RBC, är den optimala pipetten diametern 2,0-2,4 fim, vilket ger en bästa passning i ekvation 1 17,30. För det andra, för att säkerställa mätnin…
The authors have nothing to disclose.
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Table 1: Reagents/Equipment | |||
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
Table 2: Buffer solutions | |||
Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
Sucrose | 9.70g/L |