Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.
Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.
Forstå, hvordan celler opnår specifikke egenskaber under udvikling er afgørende for at forstå kompleksiteten af organer og deres potentielle udvikling mod patologiske tilstande. Der er en stor forskning skub til at dechifrere de regulerende netværk gen, der ligger til grund celle specifikation og differentiering ved unrevealing globale genekspressionsprofiler, Pol II bindende status, transskription-faktor belægning på regulatoriske sekvenser eller post-translationelle modifikationer af histoner.
For at vurdere genekspression på globalt plan microarrays og RNA-seq tilgange anvendes. Microarrays gør det muligt at detektere mRNA overflod, mens RNA-seq er bedre gearet til at informere om de forskellige typer af RNA, herunder kodning og ikke-kodende RNA som microRNA, lncRNAs eller snRNAs. Imidlertid kan disse teknikker ikke skelne aktivt transkriberet steady state mRNA, aktivt-translatoriske mRNA og mRNA ind i nedbrydningsprocessen. Måling steady-stspiste mRNA-niveauer er kendt for at være en dårlig estimering af proteom præparat 1-3. I modsætning, identificere aktivt-oversætte mRNA giver et mere præcist billede af proteinproduktion.
Imidlertid har transkriptom studier primært været ført ved hel-organisme-niveau ved at sammenligne gevinst eller tab af funktion af en specifik årsag til tilstand vildtype 4-7 eller på dissekeret væv, hvilket gør genekspressionsprofiler vanskelige at fortolke. Nylige fremskridt i cellemålrettet værktøjer, affinitetsoprensning og følsomhed forbedringer nu muligt at udføre hele genomet analyser på små cellepopulationer eller endda enkelte celler i en levende organisme.
I Drosophila, store samlinger af transgene linjer sætte specifikke tidsmæssige og rumlige målretning af forskellige væv og celle subpopulationer via GAL4 / UAS systemet 8-10 giver mere præcis kvantificering af de molekylære mekanismer, der er nødvendige for celle funktion.
<p class = "jove_content"> Blandt nyudviklede metoder polysom profilering ved fraktionering blev beskrevet som en måde at fange aktivt-oversætte RNA 11. Denne metode er baseret på sucrosegradientcentrifugering muliggør udvælgelse af polysom fraktion og bestemmelse af mRNA oversættes hele genomet ved analyse med mikroarrays eller dybe sekventering. Polysom isolation kan kobles med nucleasefordøjelse at identificere ribosomale fodspor svarende til RNA-fragmenter er beskyttet af ribosomerne under oversættelsesprocessen 12. Ribosomal fodaftryk øger nøjagtigheden af kvantificering af RNA translation og RNA-sekvens-niveauet opløsning og ribosom positionering, gør det muligt at måle hastigheden af oversættelsen. Men til dato det har ikke været anvendt til celle-specifikke isolering af translatomes, primært som følge af det kraftige fald i RNA-udbytte opnået ved afslutningen af ribosomet footprinting processen. Eftersom størrelsen udvalg af RNA kan generere potentielt falsk-positives fra forskellige RNP'er, der også kan beskytte RNA på en lignende måde, er der behov for yderligere udvikling for at forbedre ribosomale footprinting og tilpasse den til celle-specifikke tilgange.En af disse metoder, kaldet Omsætning Ribosome Affinitetsrensning (TRAP) er blevet beskrevet i 2008 af Heiman et al. og anvendes til at isolere translatome fra en delmængde af neuroner i mus. Ved epitop-mærke et ribosomalt protein i en celle-typespecifik måde kan polysomer oprenses selektivt uden besværlige trin til celledissociering og sortering. I dette tilfælde blev de 60S ribosomale protein L10a på overfladen af ribosomet mærket med eGFP 13. Siden 2008 har flere undersøgelser brugt denne metode i forskellige arter, fra mus 14-19 til X. laevis 20,21, 22,23 og zebrafisk Arabidopsis thaliana 24. TRAP fremgangsmåde er også blevet tilpasset til Drosophila modellen og anvendes til purify celletype-specifikke mRNA'er fra neuronale celler 25 og astrocytter 26. Den alsidige binære GAL4 / UAS blev anvendt til at udtrykke GFP-mærkede RpL10A i en vævsspecifik måde. Lederne af voksne fluer blev dissekeret at udføre polysom markering fra neuronale celler (målrettet af pan-neurale Elav-Gal4 driver) og isolerede RNA blev sekventeret. Det store antal up-regulerede gener svarede til dem, der er kendt for at blive udtrykt i nervesystemet, hvilket indikerer, at tilgangen har god specificitet og spørge os til at tilpasse den til sjældne cellepopulationer (mindre end 1% af celler) til stede i udviklingen af Drosophila embryoner .
Inden for Drosophila model, fosterstadiet er en model af valg for studiet af udviklingsprocesser, som de molekylære aktører og morfogenetiske bevægelser evolutionært er bevaret. De eneste vævsspecifikke transkriptomisk metoder hidtil udførte i denne model er blevet udført under anvendelse af celle eller nuklear sårting og har kun været i stand til at studere steady state transkriptom 27-31, hvilket skaber et behov for metoder dedikeret til væv / celler-specifik translatome profilering i fluen embryo. Her rapporterer vi det første TRAP protokollen dedikeret til Drosophila embryoner. Med denne metode, engageret-in-translation-mRNA i en meget begrænset cellepopulation på omkring 100 muskelceller per embryo blev succesfuldt isoleret med høj kvalitet og specificitet. Den binære GAL4 / UAS system bruges til at drive ekspressionen af GFP-mærkede RpL10A i delpopulation af muskler uden toksicitet, ingen synlige fænotyper eller forsinket udvikling, som vist tidligere 25. Drosophila embryoner besidder 30 muskler pr hemisegment, der vil give anledning til muskulaturen af larve. Ved hjælp af en regulatorisk region opdaget i nærheden af daske identitet genet, er 6 af de 30 multi-kerneholdige muskler målrettet. I dette assay er ribosomer immobiliseret på mRNA under anvendelse oversættelsen forlængelseinhibitor cycloheximid. Cytosoliske ekstrakter derefter anvendt til affinitetsoprensning med GFP-antistof-belagte magnetiske kugler. Kvaliteten af oprenset RNA blev valideret ved anvendelse af Bioanalyzer. Kvantitativ revers transskription-PCR (RT-qPCR) blev anvendt til at bestemme specificiteten og følsomheden af mRNA isolation og viste, at vores forbedrede protokollen er yderst effektive.
Dette papir beskriver en modificeret Oversættelse Ribosome Affinitetsrensning protokol (døbt 'TRAP-rc ") dedikeret til studiet af sjældne cellepopulationer i Drosophila embryoner. Er tilvejebragt på de vigtigste skridt for en vellykket isolering af specifikke RNA med et udbytte egnet til microarray eller RNA-seq analyse, dvs. 1) mængden af biologisk materiale kræves og optimeret procedure for embryo lysis og polysom ekstraktion oplysninger; 2) perler / antistof-til-lysat nøgletal for optimal immunpræcipitering; 3) trin tillader reduktion af baggrunden, herunder vaskebuffer sammensætning, således at køre TRAP-rc eksperimenter med høj specificitet og følsomhed.
Denne protokol giver reproducerbare data gør det let anvendes på andre celletyper. Denne teknik gør det muligt at analysere differentiel genekspression på niveau med aktivt-oversætte mRNA og dermed bane vejen for forståelsen protein ekspression i en spec Sp ec ifik celletype på et specifikt tidspunkt vindue. Bemærk dog, at protein overflod vil afhænge af hastigheden af oversættelses- og nedbrydningsprocesser. En væsentlig begrænsning af TRAP metode er dens manglende evne til at måle proteinindholdet på en nøjagtig kvantitativ måde eller til at detektere post-translationel modifikation. Forbedring af kvantificering ved at måle ribosom tæthed langs mRNA kroppen og i den forbindelse, i en celle-typespecifikke måde kan gøre TRAP kombineret med ribosom footprinting et meget kraftfuldt værktøj. I en nylig papir 34 blev denne kombination udført i humane embryonale nyre 293-celler. Forfatterne løb nuklease fodaftryk efterfulgt af affinitetsoprensning af en inducerbar biotinyleret form af RpL10A anvendelse af streptavidin-perler. Dette er et bevis på, at det principielt er muligt at udføre ribosom fodaftryk i en hel organisme er målrettet mod en specifik celletype, begrænsning er mængden af biologisk materiale, der kræves til dette formål.
"> Udførelse TRAP eksperimenter parallelt med globale transkriptom analyser vil gøre det muligt at spore proportioner mellem nyligt transkriberet og actively- oversætte RNA. Dette vil være dybt informativ på de potentielle post-transkriptionelle mekanismer, der finder sted i bestemte udviklingsmæssige sammenhænge eller specifikke cellepopulationer -by microRNA for eksempel.Afslutningsvis, TRAP er en yderst effektiv, specifik og følsom metode til identifikation af RNA'er bundet til aktivt-oversætte ribosomer i en celle-specifik måde. Denne metode kan anvendes i en lang række organismer og vævstyper. Den nye TRAP-rc-protokol beskrevet her blev optimeret til sjældne cellepopulationer (mindre end 1% af det samlede antal celler) og for en mængde af den endelige materiale tilstrækkeligt til efterfølgende analyser på hel-genom-niveau.
En mulig begrænsning af denne metode er kravet om en stærk drivkraft til at producere mærkede ribosomer i tilstrækkelig mængde til compete med endogene umærkede dem i den målrettede celletype. I en nylig undersøgelse 25, anslået forfattere til 10-30% forholdet mellem mærkede versus ukodede ribosomer.
For at overvinde dette problem stigende UAS-RpL10A-EGFP antal kopier vil forbedre denne balance. Alternativt vil tilføje til den beskrevne genetiske baggrund et UAS-GAL4 transgen forstærke produktionen af GAL4 protein og indirekte øger ekspression af RpL10A-EGFP. Dette bør favorisere en bedre belægning på mærkede ribosomer på mRNA.
Bemærk, at dette allerede er effektiv tilgang kan gøres endnu mere kraftfuld ved at tilpasse supplerende metoder til at bringe en mere kvantitativ aspekt eller at opdage og optrævle molekylære mekanismer der er afgørende for genekspression kontrol.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.
HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
Nuclease free water | Nalgene | ||
Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
Low binding filter tips | ClearLine | ||
Rnase free tube 1,5 mL | ClearLine | 390689DD | |
Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |