Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.
Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.
Att förstå hur celler förvärvar specifika egenskaper under utveckling är avgörande för att uppskatta komplexiteten av organ och deras potentiella utveckling mot patologiska tillstånd. Det finns en stor forsknings tryck att dechiffrera genreglerande nätverk som underliggande fastighets cell specifikation och differentiering av unrevealing globala genuttrycksprofilerna, Pol II bindande status, transkriptionsfaktor beläggning på regulatoriska sekvenser eller posttranslationella modifieringar av histoner.
För att bedöma genuttryck på global nivå mikroarrayer och RNA-punkter metoder används. Microarrays gör det möjligt att upptäcka mRNA överflöd, medan RNA-punkter är bättre rustad att informera om de olika typer av RNA, inklusive kodning och icke-kodande RNA som mikroRNA, lncRNAs eller snRNA. Dock kan dessa tekniker inte särskilja aktivt transkriberade, steady-state mRNA, aktivt-översättning mRNA och mRNA in i nedbrytningsprocessen. Mätt steady-ståt mRNA-nivåer är känd för att vara en dålig uppskattning av proteome komposition 1-3. I motsats, identifiera aktivt-översätta mRNA ger en mer rättvisande bild av proteinproduktion.
Dock har transcriptomic studier främst drivits på hel-organismnivå genom att jämföra vinst eller förlust av funktion av en specifik faktor för vildtyp tillstånd 4-7 eller dissekeras vävnad, vilket gör genuttrycksprofilerna svåra att tolka. Nya framsteg i cellinriktningsverktyg, affinitetsrening och känslighetsförbättringar tillåter nu att utföra genomtäckande analyser av små cellpopulationer eller ens enskilda celler i en levande organism.
I Drosophila, stora samlingar av transgena linjer aktivera det specifika tid och rum inriktning av olika vävnader och cell subpopulationer via GAL4 / UAS systemet 8-10 ger mer exakt kvantifiering av de molekylära mekanismer som krävs för cellfunktion.
<p class = "jove_content"> Bland nyutvecklade metoder polysom profilering genom fraktionering beskrevs som ett sätt att fånga aktivt-översätta RNA 11. Denna metod baserad på sackarosgradientcentrifugering möjliggör val av polysom fraktionen och bestämning av mRNA översatt genomet täckande vid analys med mikromatriser eller djup sekvensering. Polysom isolering kan kopplas med nukleasklyvning att identifiera ribosomala fotspår motsvarande RNA-fragment som skyddas av ribosomerna under översättningsprocessen 12. Ribosomal footprints ökar noggrannheten för kvantifiering av RNA översättning och RNA-sekvens-nivå upplösning och ribosomen positionering, gör det möjligt att mäta graden av översättning. Men hittills har det inte tillämpats på cellspecifik isolering av translatomes, främst till följd av den kraftiga minskningen av RNA erhållna utbytet vid slutet av ribosomen footprints processen. Med tanke på att storleken valet av RNA kan generera potentiella falskt positives från olika RNP som också skulle kunna skydda RNA på ett liknande sätt, är ytterligare utveckling för att förbättra ribosomala fotavtryck och anpassa den till cellspecifika strategier.En av dessa metoder, som kallas Översättning Ribosom Affinity Purification (TRAP) har beskrivits i 2008 av Heiman et al. och tillämpas för att isolera translatome från en undergrupp av neuroner i möss. Genom epitop märkning ett ribosomalt protein i en cell-typ-specifikt sätt, kan polysomer selektivt renas utan den arbetskrävande steget att cell dissociation och sortering. I det här fallet var de 60S ribosomalt protein L10a vid ytan av ribosomen taggade med EGFP 13. Sedan 2008 har flera studier använt denna metod i olika arter, från möss 14-19 till X. laevis 20,21, zebrafisk 22,23 och Arabidopsis thaliana 24. TRAP metoden har också anpassats för att Drosophila-modellen och används för att purify celltyp-specifika mRNA från nervceller 25 och astrocyter 26. Den mångsidiga binära GAL4 / UAS system användes för att uttrycka GFP-märkta RpL10A på ett vävnadsspecifikt sätt. Cheferna för vuxna flugor dissekerades att utföra polysom urval från nervceller (riktade av pan-neural Elav-Gal4 förare) och isolerade RNA sekvenserades. Det stora antalet up-reglerade gener motsvarade de som är kända för att uttryckas i nervsystemet, vilket visar att inställningen har god specificitet och föranledde oss att göra det sällsynta cellpopulationer (mindre än 1% av celler) förekommer i utvecklings Drosophila embryon .
Inom Drosophila modellen är i fosterstadiet en modell av val för att studera utvecklingsprocesser, som de molekylära aktörer och morfogenetiska rörelser evolutionärt bevarade. De enda vävnadsspecifika transcriptomic metoder som hittills genomförts i denna modell har utförts med hjälp av cell eller kärn sårting och har bara kunnat studera steady-state transkriptom 27-31, vilket skapar ett behov av metoder avsedda för vävnader / cellspecifik translatome profilering i gylfen embryot. Här rapporterar vi den första TRAP protokollet tillägnad Drosophila embryon. Med denna metod, som bedriver-i-translation-mRNA i en mycket begränsad cellpopulation på cirka 100 muskelceller per embryo lyckades isolerades med hög kvalitet och specificitet. Den binära GAL4 / UAS system används för att driva uttrycket av GFP-märkta RpL10A i subpopulationen av muskler utan någon toxicitet, inga uppenbara fenotyper eller utvecklingsförsening som visats tidigare 25. Drosophila embryon besitter 30 muskler per hemisegment som kommer att ge upphov till muskulaturen av larven. Genom att använda en regulatorisk region upptäcktes i närheten av slöfock identitets genen, 6 av de 30 fler kämförsedda muskler är riktade. I denna analys är ribosomer immobiliseras på mRNA med användning av översättnings töjninginhibitor cykloheximid. Cytosolextrakt används sedan för affinitetsrening med GFP-antikropp-belagda magnetiska pärlor. Kvaliteten på renat RNA validerades med Bioanalyzer. Kvantitativ omvänd transkription-PCR (RT-qPCR) användes för att bestämma specificiteten och känsligheten för mRNA-isolering och visade att vår optimerat protokoll är mycket effektiv.
Detta dokument beskriver en modifierad Översättning Ribosom Affinity Purification protokoll (kallas "TRAP-rc") ägnar sig åt studier av sällsynta cellpopulationer i Drosophila embryon. Information ges om de viktigaste stegen för framgångsrik isolering av specifik RNA med en avkastning som är lämpliga för microarray eller RNA-punkter analys, det vill säga 1) mängden biologiskt material som krävs och optimerad procedur för embryo lys och polysom extraktion; 2) pärlor / antikropp-to-lysat förhållanden för optimal immunoprecipitation; 3) steg tillåter minskning av bakgrunds inklusive tvättbuffertsammansättning för att köra TRAP-rc experiment med hög specificitet och sensitivitet.
Detta protokoll ger reproducerbara uppgifter som gör det lätt tillämpas på andra celltyper. Denna teknik gör det möjligt att analysera differentiell genuttryck i nivå med aktivt-översätta mRNA och därmed bana väg för att förstå proteinuttryck i en spec IFIC celltyp vid en specifik tid. Observera dock att protein överflöd beror på graden av översättnings- och nedbrytningsprocesser. En viktig begränsning av TRAP-metoden är dess oförmåga att mäta proteinhalten i ett exakt kvantitativt sätt eller för att upptäcka posttranslationell modifiering. Att förbättra kvantifiering genom att mäta ribosomen täthet längs mRNA kroppen och därigenom i en cell-typ-specifikt sätt kan göra TRAP i kombination med ribosomen footprint ett mycket kraftfullt verktyg. I en nyligen papper 34, var denna kombination utförs i humana embryonala njur-293-celler. Författarna sprang nukleas footprints följt av affinitetsrening av en inducerbar biotinylerad form av RpL10A använder streptavidinpärloma. Detta är ett bevis på principen att det är möjligt att utföra ribosomen footprints i en hel organism samtidigt rikta en viss celltyp, begränsningen är mängden biologiskt material som krävs för ändamålet.
"> Utföra TRAP experiment parallellt med globala transcriptomic analyser kommer att göra det möjligt att spåra proportioner mellan nyligen transkriberas och actively- översätta RNA. Detta kommer att vara djupt informativ om de potentiella posttranskriptionell mekanismer som äger rum i särskilda utvecklingssammanhang eller specifika cellpopulationer -Genom mikroRNA till exempel.Sammanfattningsvis är TRAP en mycket effektiv, specifik och känslig metod för att identifiera RNA bundna till aktivt-översätta ribosomer i ett cellspecifikt sätt. Denna metod kan användas i ett stort antal olika organismer och vävnadstyper. Den nya TRAP-rc protokoll som beskrivs här var optimerad för sällsynta cellpopulationer (mindre än 1% av det totala antalet celler) och en mängd färdiga materialet tillräckligt för efterföljande analyser på hel-genomnivå.
En möjlig begränsning med denna metod är kravet på en stark drivkraft för att producera märkta ribosomer i tillräcklig mängd för att compete med endogena omärkta dem i riktade celltyp. I en nyligen genomförd studie 25, författare uppskattas till 10-30% förhållandet taggade kontra omärkta ribosomer.
För att lösa detta problem ökar UAS-RpL10A-EGFP antal kopior bör avsevärt förbättra denna balans. Alternativt kommer att lägga till den beskrivna genetiska bakgrunden en UAS-GAL4 transgen förstärka produktionen av GAL4 protein och indirekt öka uttrycket av RpL10A-EGFP. Detta bör gynna en bättre beläggning av märkta ribosomer på mRNA.
Observera att kan göras detta redan effektiv strategi ännu kraftfullare genom att anpassa kompletterande metoder för att få en mer kvantitativ aspekt eller för att upptäcka och avslöja molekylära mekanismer som är nödvändiga för genuttryck kontroll.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.
HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
Nuclease free water | Nalgene | ||
Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
Low binding filter tips | ClearLine | ||
Rnase free tube 1,5 mL | ClearLine | 390689DD | |
Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |