कृंतक मस्तिष्क Microinjection आण्विक Substrates प्रेरित व्यवहार का अध्ययन करने के लिए
Summary
Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Abstract
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Introduction
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया microinjection cannulae और प्रेरित व्यवहार की आणविक substrates elucidating में सहायता करेगा कि microinjectors निर्माण करने के लिए एक कारगर साधन है। इस विधि के कई लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, एक के अपने प्रत्यारोपण और microinjectors निर्माण से, उपन्यास प्रयोगात्मक मानकों तेजी से अनुकूलित किया जा सकता है, यानी, एक आने के लिए कस्टम मेड घटकों के लिए इंतजार करने की जरूरत नहीं है। दूसरा, प्रवेशनी के छोटे व्यास के कारण अधिक cannulae एक साथ प्रत्यारोपित किया जा सकता है। इस बचे रहने में सुधार कर सकते हैं जो आवश्यक शल्य समय, कम करता है तथा यह भी पशु के प्रति एकाधिक प्रत्यारोपण की अनुमति देता है। एक निश्चित अनुपात प्रतिमान तेजी से बस इच्छित सुदृढीकरण अनुसूची में शामिल है कि एक घटना के लिए संक्रमण पैरामीटर सूची को लागू करने से एक प्रगतिशील अनुपात प्रतिमान के लिए परिवर्तित किया जा सकता है, क्योंकि तीसरा, स्फूर्त कक्षों नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर आसानी से प्रगतिशील अनुपात कार्यक्रम accommodates।
होने के लिएमोटे तौर पर उपयोगी है, एक सामान्य microinjection प्रक्रिया वर्तमान में उपलब्ध लगभग किसी भी अभिकर्मक के microinjection के लिए मोटे तौर पर लागू किया जाना चाहिए कि प्रस्तुत किया गया था। नतीजतन, हम इस तकनीक को मामूली संशोधन के साथ भविष्य में इसी तरह उच्च उपयोगिता का होना जारी रहेगा आशा करते हैं कि। केवल कुछ ही चर बदल रहा है, इस दृष्टिकोण अभिकर्मकों की एक विस्तृत संख्या के लिए लागू किया जा सकता है। सबसे अधिक इस्तेमाल चालाकी से किया जाएगा कि पैरामीटर्स microinjector प्रवेशनी से protrudes कि लंबाई, इंजेक्शन की मात्रा और इंजेक्शन की दर शामिल हैं। उदाहरण के लिए, एक सुई लगानेवाला आम तौर पर पुरानी प्रत्यारोपण के आसपास रूपों कि glial निशान से बचने के लिए प्रवेशनी सिरे से आगे बढ़ाना चाहते हो सकता है। इसके अतिरिक्त, एक एक बड़ी मात्रा इंजेक्षन करने के लिए इच्छा हो सकती है। कि उपयोग की तुलना में (10 मिनट अतिरिक्त प्रसार समय अक्सर 7 – – 10 मिनट प्लस 3) स्ट्रिआटल वायरस microinjections के लिए, 1 μL की मात्रा आम तौर पर इस्तेमाल किया जाता है और इस खंड में आम तौर पर समय की एक लंबी अवधि में इंजेक्ट किया जाता हैऔषधीय अभिकर्मकों के लिए डी (आम तौर पर 0.3 – 3 मिनट प्लस 1 – – 2 से अधिक 0.5 μL 3 मिनट के अतिरिक्त प्रसार समय)। उपयोगकर्ता साहित्य से परामर्श और / या अनुभव से सबसे अच्छा अपनी आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त मानकों का निर्धारण करना चाहिए। इंजेक्शन के लिए पहले microinjector स्प्रे पैटर्न का 1) प्रवेशनी लंबाई, 2) microinjector लंबाई, 3) गुणवत्ता, और 4) प्रणाली अखंडता: भले ही, इस प्रक्रिया की सफलता 4 चर पर निर्भर है। Microinjection के स्थान microinjector प्रवेशनी से protrudes कि गहराई पर निर्भर है, क्योंकि दोनों cannulae (चरण 1.2.8) और microinjector लंबाई (पोस्ट झुकने, चरण 2.2.1) दोनों ठीक सभी विषयों के बीच जाना जाता है और एक समान हैं, कि यह जरूरी है । यह आसानी से आसानी से किसी भी है कि अंतिम फिर से मापने पर आवश्यक लंबाई नहीं है लागू खारिज द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। यह गाइड प्रवेशनी नीचे तुरंत होता है, तो इसके अलावा, इंजेक्शन स्थान ही अनुमान लगाया जा सकता है। इस प्रकार, किसी microinjector हरिणी किपरीक्षण पर एक लंबे, ठीक धारा स्प्रे नहीं है (कदम 2.4.6) को खारिज कर दिया जाना चाहिए। एक गुणवत्ता इंजेक्शन भी इंजेक्शन के लिए पहले प्रणाली की अखंडता से संबंधित है। कई स्थानों प्रयोगशाला-पोंछ पर मनाया जाता है इंजेक्टर से सब पानी वितरण के बाद (पूर्व अभिकर्मक के साथ भरने के लिए) है, तो एक रिसाव (चरण 2.4.8 पर ध्यान दें) निवारण किया जाना चाहिए। PE20 ट्यूबिंग में पानी से दवा है कि अलग बुलबुला (चरण 2.4.9) एक नहीं, एक बुलबुला (अभिकर्मक के साथ microinjector भरने के बाद) है, तो आगे, तो इंजेक्टर आंशिक रूप से भरा हुआ है। इस रोकना रोकने या इंजेक्शन हटाने सकता है या तो। यह भी आसानी से remedied किया जा सकता (नोट कदम 2.4.8 पर)।
एक से तीन विकल्प हैं पशु stereotaxic फ्रेम में है, जबकि microinject करना चाहते हैं। सबसे पहले, एक यह stereotaxic जोड़तोड़ से मजबूती से आयोजित की और भी PE20 ट्यूबिंग के लिए कनेक्शन की अनुमति के लिए काफी दूर तक विस्तार किया जा सकता है कि इस तरह microinjector कॉलर की लंबाई में वृद्धि कर सकता है। दूसरा, परई अस्थायी एक प्रवेशनी प्रत्यारोपण और यहाँ प्रस्तुत मानक microinjector इस्तेमाल कर सकते हैं। तीसरा, एक खींचा और पॉलिश कांच pipettes का उपयोग कर सकता है। 16,17
यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि यह सबसे अच्छा प्रक्रिया से परिचित हैं कि अच्छी तरह से संभाला चूहों में आयोजित किया जाता है। एक ही अन्वेषक 2 महीने के लिए एक दैनिक आधार पर चूहों संभाला क्योंकि परिणाम अनुभाग में वर्णित डेटा के लिए इस्तेमाल किया चूहे कोई विशेष हैंडलिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। यह कम से कम 2 सप्ताह के लिए शल्य प्रत्यारोपण के दैनिक अवलोकन और हेरफेर शामिल थे। हालांकि, चूहों तेजी से तनाव से प्रभावित किया जा सकता है, जो पूर्व पल्स निषेध परख करने से पहले करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कि तकनीक की एक संख्या से आदी जा सकता है। इन विशेष आदी होना तकनीक अच्छी तरह से पहले से विस्तृत किया गया है। 43 इन प्रक्रियाओं के अलावा, यह चूहों छोटा microinjectors डु उपयोग किया जाता है, जहां microinjection प्रक्रिया के आदी हो कि सलाह दी जाती हैरिंग 'दिखावा' इंजेक्शन। इन नकली इंजेक्शन के दौरान, यह microinjector ऊतकों को नुकसान सीमित करने के क्रम में ऊतक में फैलाना नहीं कि महत्वपूर्ण है। दूसरे शब्दों में, microinjector नहीं रह गया है 14 मिमी की तुलना में तुला होना चाहिए। इस प्रकार, इस तकनीक का इष्टतम कार्यान्वयन के लिए आवश्यक पूरी तरह से आदी होना एक सीमा के रूप में देखा जा सकता है।
कई व्यवहार मानदंड प्रेरणा को मापने के लिए मौजूद हैं, प्रगतिशील अनुपात आमतौर पर इस विषय में एक सुदृढ़कर्ता प्राप्त करने के लिए लागू करने के लिए तैयार है कि प्रयास यों इस्तेमाल किया जाता है। प्रगतिशील अनुपात प्रतिमान अक्सर पिछले पूरा अनुपात में लीवर प्रेस की अधिक से अधिक संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है जो ब्रेकप्वाइंट के रूप में जाना जाता है एक उपाय है, का उत्पादन;।। यानी, अधिक से अधिक है कि एक सुदृढ़कर्ता उत्पन्न जवाब 21 प्रगतिशील अनुपात परिमाण सुदृढ़कर्ता के प्रति संवेदनशील है। उदाहरण के लिए, उच्च कोकीन (या सूक्रोज) खुराक एक उच्च ब्रेकप्वाइंट और कम कोकीन (या सूक्रोज) खुराक एक कम breakp उपज का उत्पादनoint। 21,22 तदनुसार, ब्रेकप्वाइंट प्रेरणा और / या मजबूत करने प्रभावकारिता के लिए एक नियमित रूप से इस्तेमाल प्रॉक्सी है। 21,23-26 ब्रेकप्वाइंट का इरादा पशु जवाब बंद हो जाता है जब यह निर्धारित करने के लिए है, क्योंकि प्रगतिशील अनुपात प्रतिमान का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है सत्र की लंबाई। परिमित सत्र लंबाई ब्रेकप्वाइंट मूल्यों पर एक झूठी टोपी रख सकते हैं और यह असामान्य रूप से आत्म-प्रशासन या कि वृद्धि के बाद सुदृढीकरण रोक की दर में कमी है कि पूर्व उपचार द्वारा exacerbated किया जा सकता है। । यह उलझाना दृष्टिकोण के किसी भी नंबर से दूर किया जा सकता है;। उदाहरण के लिए, सत्र पशु औसत अंतर-अर्क अंतराल के कुछ एकाधिक द्वारा जवाब रोक लगाई गई है जब समाप्त कि 44 इस दृष्टिकोण का एक और आमतौर पर लागू किया संस्करण है जवाब एक बार सत्र समाप्त करने के लिए है विषयों भर में लगातार आयोजित किया जाता है कि कुछ अनुभव से निर्धारित मूल्य से रोक दिया गया। हम कदम 4.4.9.11 में इस दृष्टिकोण को लागू करने की विधि प्रदान की है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Materials
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
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