Dalbavancin के लिए एक संदर्भ रसा Microdilution विधि<em> इन विट्रो</emAerobically उगने वाले बैक्टीरिया की> संवेदनशीलता परीक्षण

Summary

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Abstract

रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) विभिन्न जीवाणुओं के खिलाफ रोगाणुरोधी एजेंटों की इन विट्रो गतिविधि का आकलन करने के लिए किया जाता है। न्यूनतम निरोधात्मक सांद्रता (MICS) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं जो एएसटी परिणाम, प्रतिरोध विकास के रोगाणुरोधी विकास और निगरानी के लिए अनुसंधान के क्षेत्र में और रोगाणुरोधी चिकित्सा मार्गदर्शन के लिए नैदानिक ​​सेटिंग में इस्तेमाल कर रहे हैं। Dalbavancin ग्राम पॉजिटिव जीवों की वजह से तीव्र जीवाणु त्वचा और त्वचा संरचना संक्रमण के इलाज के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) ने मई 2014 में मंजूरी दी थी कि एक अर्द्ध सिंथेटिक lipoglycopeptide रोगाणुरोधी एजेंट है। वर्तमान विरोधी स्ताफ्य्लोकोच्कल उपचारों से अधिक dalbavancin का लाभ एक बार साप्ताहिक खुराक के लिए अनुमति देता है जो अपने लंबे आधा जीवन है। Dalbavancin, coagulase नकारात्मक staphylococci (दोनों मेथिसिलिन-अतिसंवेदनशील एस ऑरियस [MSSA] और मेथिसिलिन-प्रतिरोधी एस ऑरियस [मरसा] सहित) स्ताफ्य्लोकोच्चुस के खिलाफ गतिविधि है <em> स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया, स्ट्रेप्टोकोकस anginosus समूह, β रक्तलायी स्ट्रेप्टोकोक्की और vancomycin के अतिसंवेदनशील Enterococci। प्लास्टिक के लिए एजेंट का पालन कम करने के लिए शेयर समाधान और Polysorbate 80 (P80) की तैयारी हाल के एक अन्य lipoglycopeptide एजेंटों, CLSI और आईएसओ शोरबा संवेदनशीलता परीक्षण तरीकों का अनुकूलन करने के लिए इसी तरह की एक विलायक के रूप में डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) का उपयोग भी शामिल है। नैदानिक ​​अध्ययन करने के लिए और dalbavancin के प्रारंभिक विकास के दौरान पहले, संवेदनशीलता के अध्ययन पी 80 के उपयोग के साथ प्रदर्शन किया और एमआईसी परिणाम 2-4 गुना अधिक है और इसी तरह उच्च एमआईसी परिणाम अगर कमजोर पड़ने संवेदनशीलता विधि के साथ प्राप्त किया गया हो जाती थी नहीं कर रहे थे। Dalbavancin पहली बार 2005 में CLSI शोरबा microdilution कार्यप्रणाली तालिकाओं में शामिल और DMSO और पी 80 के उपयोग को स्पष्ट करने के लिए 2006 में संशोधन किया गया था। शोरबा microdilution यहाँ दिखाया गया है (बीएमडी) प्रक्रिया dalbavancin के लिए विशिष्ट है और कदम-दर-कदम विस्तार और संस्कृति और उसके साथ CLSI और आईएसओ तरीकों के अनुसार हैमहत्वपूर्ण कदम पर हमें स्पष्टता के लिए जोड़ा।

Introduction

Dalbavancin ग्राम पॉजिटिव जीवों ¹ की वजह से तीव्र जीवाणु त्वचा और त्वचा संरचना संक्रमण के इलाज के लिए मई 2014 में एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया था कि एक अर्द्ध सिंथेटिक lipoglycopeptide है। एक वीडियो प्रारूप में इस पद्धति का ब्यौरा का प्राथमिक लक्ष्य सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य dalbavancin संवेदनशीलता परिणामों का परीक्षण और रिपोर्टिंग के लिए नैदानिक ​​प्रयोगशाला और अनुसंधान वैज्ञानिकों को स्पष्ट मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए है।

वाणिज्यिक तरीकों से एक रोगाणुरोधी एजेंट एमआईसी के निर्धारण को नियमित रोगजनक बैक्टीरिया के खिलाफ एक एजेंट के इन विट्रो गतिविधि के आकलन के लिए नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में किया जाता है। CLSI और आईएसओ ^2,3,4 की सिफारिश के अनुसार यहाँ वर्णित विधि शोरबा microdilution विधि है। और डिस्क प्रसार और अगर कमजोर पड़ने के तरीके (इस प्रकाशन के समय) वाणिज्यिक संवेदनशीलता तरीकों वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं dalbavancin के बाद से वर्तमान में च सिफारिश नहीं कर रहेया dalbavancin, संदर्भ शोरबा कमजोर पड़ने तरीकों ^12,14 उपलब्ध मौजूदा विकल्प हैं। इस संदर्भ विधि एक वाणिज्यिक नहीं है और एफडीए एक प्रयोगशाला विकसित टेस्ट (LDT) के लिए नियामक आवश्यकताओं का पालन करना चाहिए रोगी के परीक्षण के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग कि संयुक्त राज्य अमेरिका में इन विट्रो नैदानिक ​​विधि, नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं को मंजूरी दे दी है। यह dalbavancin उपयोग बढ़ जाती है, और अधिक प्रयोगशालाओं इस परिसर का परीक्षण करने के लिए एक की जरूरत है जाएगा अनुमान है कि। एस के dalbavancin संवेदनशीलता के निर्धारण के लिए एक किराए के रूप vancomycin परीक्षण ऑरियस ⁵ मान्य किया गया है। हालांकि, dalbavancin vancomycin के मध्यवर्ती एस के खिलाफ सक्रिय हो सकता है ऑरियस (वीजा) और इसलिए, चिकित्सकों dalbavancin एमआईसी परिणाम अनुरोध कर सकते हैं। इसके अलावा, अन्य प्रजातियों के जीवाणु के लिए एमआईसी परिणाम का अनुरोध किया जा सकता है।

एस के खिलाफ dalbavancin के लिए एफडीए अतिसंवेदनशील ब्रेकप्वाइंट ऑरियस ≤0.12 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में स्थापित किया गया है। एफडीए सौंपा केवल एक susceptiक्योंकि प्रतिरोधी वियोजन पर डेटा की कमी की ble श्रेणी। जंगली प्रकार एस के बीच सामान्य एमआईसी वितरण ऑरियस आइसोलेट्स 0.06 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की एक स्पष्ट मोडल एमआईसी के साथ माइक्रोग्राम 0.03-0.12 के बीच / एमएल, है। कारण विधि अंतर करने के लिए एमआईसी परिणामों में एक मामूली बदलाव, ± एक कमजोर पड़ने के निहित बीएमडी भिन्नता के अलावा, संभावित संवेदनशीलता दरों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। अन्य lipoglycopeptide एजेंटों के लिए इसी प्रकार ^6, dalbavancin संवेदनशीलता परीक्षण एक परिणाम के रूप में चुनौतीपूर्ण हो सकता है घुलनशीलता और अणु के अपेक्षाकृत बड़े आकार और इसकी बाइंडिंग गुण ^7,8,9 की। यहाँ वर्णित संदर्भ बीएमडी विधि अघुलनशील एजेंटों और / या lipoglycopeptide एजेंटों के लिए अद्वितीय हैं कि दो विशिष्ट चरणों में शामिल हैं: (1) अंतिम एमआईसी पैनल में स्टॉक समाधान की तैयारी और 0.002% पी-80 (2) के अलावा के लिए DMSO के उपयोग dilutions। इस वीडियो के प्रकाशन का उद्देश्य dalbavancin बीएमडी विधि करने के लिए और specifica के लिए स्पष्टता प्रदान करने के लिए हैlly सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एमआईसी परिणाम आश्वासन, इन महत्वपूर्ण कदम पर ध्यान केंद्रित।

Protocol

रोगाणुरोधी संवेदनशीलता 2, 3, 4 के लिए संदर्भ शोरबा microdilution विधि की पूरी जानकारी के लिए CLSI दस्तावेजों M7-A10 और M100-S25 और / या आईएसओ / एफ डी आई 20776-1 का संदर्भ लें संदर्भ तरीकों में से कुछ में विकल्प के लिए अनुमति देते हैं: ध्यान दें। inoculum तैयारी और एमआईसी पैनल उत्पादन के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं ही अंतिम परिणाम प्राप्त करने के लिए। यहाँ विस्तृत विधि एक रोगाणुरोधी एजेंट, dalbavancin से संबंधित है, और कदम से कुछ संदर्भ प्रक्रिया किया जा सकता है, संभवतः कई तरीकों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। (जैव सुरक्षा स्तर 2 के साथ संगत) उचित सुरक्षा सावधानियों 10 उपयोग किया जाना चाहिए। इस वीडियो को प्रकाशन के उद्देश्य के लिए इस्तेमाल एमआईसी पैनल प्रारूप तालिका 1 में दिखाया गया है। 1. स्टोर Dalbavancin पाउडर एक गैर defrosting फ्रीजर में एक सूखा वातावरण में -20 ओ सी में नैदानिक ​​ग्रेड dalbavancin पाउडर, दुकान के प्राप्त होने पर। का उपयोग करने से पहले, पाउडर को संतुलित करना चाहिएउद्घाटन से पहले आर टी तक पहुँचने। 2. एमआईसी पैनल dilutions तैयार बाँझ कांच या प्लास्टिक की नलियों में साफ (शुद्ध) DMSO में dalbavancin का कोई अधिक से अधिक 1600 माइक्रोग्राम / एमएल एक शेयर समाधान तैयार है, और -60 ओ सी के लिए या नीचे में भविष्य में उपयोग के लिए -20 पर तैयारी या दुकान के एक ही दिन पर उपयोग एक गैर defrosting फ्रीजर। पाउडर जब वजन पाउडर के साथ प्राप्त प्रलेखन पर प्रदान के रूप में ध्यान में dalbavancin की शक्ति ले लो, (उदाहरण के 800 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर तैयारी के लिए समीकरण 1 देखें)। बाँझ कांच या प्लास्टिक की नलियों में साफ DMSO के साथ तालिका 2 में 1 कॉलम ("स्रोत एकाग्रता") में दिखाया गया है योजना के लिए इसी तरह के शेयर कमजोर पड़ने पतला। मंदक और पहली ट्यूब करने के लिए प्रारंभिक dalbavancin शेयर जोड़ने के लिए एक और pipet को मापने के लिए एक pipet का प्रयोग करें। प्रत्येक बाद dalbavancin शेयर एकाग्रता के लिए एक नया pipet का उपयोग करें। 100X अंतिम एमआईसी पैनल एकाग्रता तैयारसाफ DMSO के साथ राशन dilutions (मध्यवर्ती सांद्रता)। कॉलम तालिका 2 के 2-4 में दिखाया गया है, (किए जाने के लिए एमआईसी पैनलों की संख्या पर निर्भर करेगा प्रयोग की जाने वाली मात्रा) वांछित मध्यवर्ती एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए स्रोत और DMSO की उचित मात्रा गठबंधन। 0.004% P80 तैयार: 4.9 मिलीलीटर DH 2 ओ में 0.1 मिलीलीटर P80 जोड़कर 2% P80 के एक ताजा काम कर शेयर समाधान तैयार तैयारी का एक ही दिन में 0.22 माइक्रोन फिल्टर और उपयोग समाधान के माध्यम से गुजर द्वारा जीवाणुरहित। (CAMHB के 149.7 मिलीलीटर जैसे, 0.3 मिलीलीटर में 2% की P80) 500 कमजोर पड़ने 2% की P80 एक 1: बनाकर 0.004% P80 मंदक तैयार करें। इसके अलावा 2.2 चरण 1 में तैयार मध्यवर्ती सांद्रता पतला: 100 0.004% के साथ पूरक केशन समायोजित मुलर हिंटन शोरबा (CAMHB) में (वी / वी): Polysorbate-80 (पी-80) पी -80 और / या एलएचबी (स्ट्रेप्टोकोक्की के लिए) जोड़ा 2 कमजोर पड़ने: डबल अंतिम एकाग्रता में inoculum (4.3 चरण) के अलावा एक 1 में परिणाम होगा क्योंकि। 2 टेबल में स्तंभों 6 और 7 देखें </st> रोंग। 3. एमआईसी पैनलों तैयार एमआईसी पैनल की उचित कुओं में 2.3 कदम में तैयार प्रत्येक dalbavancin समाधान के 50 μl बांटना और (अच्छी तरह से विकास नियंत्रण) केवल एक कुएं में मीडिया शामिल हैं। बाँझ सुझावों के साथ एक मल्टी चैनल pipet के इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तुरंत पैनलों का प्रयोग करें या प्लास्टिक की थैलियों में प्लास्टिक की फिल्म, जगह के साथ सील और तुरंत ≤ -20 ओ सी (अधिमानतः ≤ -60 ओ सी) जब तक जरूरत पर एक गैर-defrosting फ्रीजर में रखें। जमे हुए पैनलों का इस्तेमाल किया जाता है, तो जवानों को हटा दें और अच्छी तरह से (सामग्री thawed हैं जब तक) पैनल टीका करने के लिए आगे बढ़ने से पहले 15-30 मिनट के लिए प्रयोगशाला बेंच पर अलग-अलग पैनलों जगह है। 4., एमआईसी पैनलों टीका लगाना पवित्रता और सेटअप कालोनी गिनती प्रदर्शन एक 18-24 घंटा रक्त अगर या अन्य गैर चयनात्मक अगर थाली से कई अच्छी तरह से अलग-थलग कालोनियों का चयन करें। 1-5 मिलीलीटर CAMHB या एस के लिए एक बाँझ पाश या झाड़ू और हस्तांतरण के साथ प्रत्येक कॉलोनी के शीर्ष को स्पर्शमैलापन तक Aline एक 0.5 मैकफ़ारलैंड मानक के बराबर है। 0.5 मैकफ़ारलैंड करने के लिए या एक भामिति डिवाइस के साथ दृश्य तुलना द्वारा मैलापन का आकलन करें। CAMHB में 100 (100 μl 10 मिलीलीटर CAMHB में): तैयारी के 15-30 मिनट के भीतर, inoculum 1 पतला। एस के अपवाद के साथ dalbavancin के खिलाफ जांच की सबसे बैक्टीरिया के लिए निमोनिया, इस कमजोर पड़ने 5 एक्स 10 5 सीएफयू / एमएल के एक अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता (स्वीकार्य सीमा 2-8 एक्स 10 5 सीएफयू / एमएल) प्रदान करेगा। एस के लिए निमोनिया, एक 0.5 मैकफ़ारलैंड करने में गंदगी की तुलना के आधार पर बैक्टीरियल एकाग्रता इसलिए, (10 मिलीलीटर CAMHB + 10% + एलएचबी में 400 μl) inoculum 01:25 पतला, काफी कम आम तौर पर है। Inoculum तैयारी के बाद 15 मिनट के भीतर, बाँझ सुझावों का उपयोग कर एक मल्टी चैनल pipet के इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता चरण 3 में तैयार एमआईसी पैनल की (बाँझपन नियंत्रण के अपवाद के साथ-साथ) अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए अंतिम inoculum के 50 μl हस्तांतरण। एक शुद्धता की जांच करनेस्थानांतरित करने और अच्छी तरह से एक गैर-चयनित अगर (5% भेड़ रक्त के साथ जैसे, trypticase सोया अगर) के लिए एक बाँझ पाश का उपयोग सकारात्मक वृद्धि नियंत्रण से 1-10 μl विभाज्य के प्रसार के द्वारा। (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) खारा के 10 मिलीलीटर के लिए विकास नियंत्रण में अच्छी तरह से एक चैनल pipet और बाँझ टिप और हस्तांतरण से 10 μl हटाने के द्वारा सेटअप कॉलोनी गिनती। अलग अलग दिशाओं में दो बार मिश्रण और एक उपयुक्त, गैर-चयनित अगर मध्यम (जैसे, trypticase सोया 5% भेड़ रक्त के साथ अगर) और एक बाँझ पाश के साथ पूरे अगर सतह पर फैला हुआ, दोहरा करने के लिए एक चैनल pipet और बाँझ टिप के साथ 100 μl हस्तांतरण inoculum (1:10 कमजोर पड़ने) का भी वितरण आश्वस्त करने के लिए। 5. सेते एमआईसी पैनलों, कॉलोनी गिनती और पवित्रता प्लेट्स प्लास्टिक टेप के साथ या incubating से पहले एक चुस्त प्लास्टिक कवर के साथ, एक प्लास्टिक की थैली में कोई अधिक से अधिक 4 पैनलों में से प्रत्येक के एमआईसी पैनल या ढेर सील। वैकल्पिक रूप से, टी पर खाली एमआईसी पैनल जगहकोई अधिक से अधिक 4 एमआईसी पैनल के ढेर के सेशन, एक प्लास्टिक कंटेनर में एक नम कागज तौलिया जगह, प्लास्टिक कंटेनर और सुरक्षित रूप से ढक्कन के साथ बंद कंटेनर में जगह एमआईसी पैनलों। 16-20 घंटा (staphylococci और Enterococci) और टीका के 30 मिनट के भीतर 20-24 घंटा (स्ट्रेप्टोकोक्की) के लिए 35 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस पर एक परिवेशी वायु इनक्यूबेटर में एमआईसी पैनलों सेते हैं। एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते स्ट्रेप्टोकोक्की को छोड़कर एक ही परिस्थितियों में कॉलोनी गिनती और पवित्रता प्लेटें सेते हैं। 6. एमआईसी पढ़ें और कॉलोनी प्लेट्स गणना; पवित्रता प्लेट जाँच पूरी तरह से बेबस नजर से पता चला के रूप में कुओं में बैक्टीरिया विकास को रोकता है कि सबसे कम एकाग्रता के रूप में एमआईसी पढ़ें। कॉलोनी गिनती प्लेट पर कालोनियों की गणना करें। कमजोर पड़ने कारक (1: 10,000) द्वारा प्रत्येक कॉलोनी गुणा (जैसे, 50 कालोनियों 5 एक्स 10 5 सीएफयू / एमएल के बराबर है)। एक स्वीकार्य सीमा 20-80 कालोनियों है (2-8 एक्स 10 5 सीएफयू / एमएल) और एक appro के रूप में प्रयोग किया जाता हैximate दिशानिर्देश। पवित्रता प्लेट की जाँच करें। सभी कालोनियों 4.1 चरण में इस्तेमाल कालोनियों के समान होते हैं, तो फिर inoculum शुद्ध माना जा सकता है। वर्तमान में किसी भी अन्य कालोनियों देखते हैं तो एक contaminant एमआईसी पैनल में उपस्थित होने के लिए और परीक्षण दोहराया जाना चाहिए के लिए, तो संभावना है। 7. चेक गुणवत्ता नियंत्रण परिणाम। CLSI गुणवत्ता नियंत्रण उपभेदों की उम्मीद पर्वतमाला के लिए 3 टेबल को देखें। केवल गुणवत्ता नियंत्रण जीव (एस) के लिए dalbavancin एमआईसी परिणाम की उम्मीद की सीमा के भीतर हैं आइसोलेट्स यदि परीक्षण के परिणाम की रिपोर्ट। ≥0.25 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एमआईसी किसी भी नैदानिक ​​एस के लिए प्राप्त की है तो ऑरियस dalbavancin एमआईसी परीक्षण दोहराने और / या सत्यापन के लिए एक संदर्भ प्रयोगशाला के लिए भेज, अलग।

Representative Results

मानकीकृत एमआईसी तरीकों प्रतिरोध विकास, विभिन्न रोगाणुरोधी निगरानी कार्यक्रमों का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य पर नजर रखने के लिए आवश्यक हैं। 2011-2013 में यूरोप और अमेरिका में एकत्र वियोजन के लिए Dalbavancin एमआईसी परिणाम S.aureus के 99.9% और स्ट्रेप्टोकोक्की की 100% (तालिका 4) के लिए <0.25 माइक्रोग्राम / एमएल थे। ताजा (सील) DMSO, क्यूसी उपभेदों एस के लिए dalbavancin बीएमडी MICS की तीन प्रतियों परीक्षण का उपयोग कर के महत्व का आकलन करने के लिए ऑरियस ATCC 29,213, और ई और ATCC 29212 faecalis एस के लिए परीक्षण नकल निमोनिया ATCC 49619 समाप्ति की तारीख के भीतर था और 2 साल के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया था कि एक 1 एल बोतल से सील ampules से (1) DMSO, (2) DMSO उपयोग किया गया था (3) एक ही 1 एल से DMSO के एक विभाज्य उपयोग करने से पहले 72 घंटे के लिए एक खुला बीकर में बैठने की अनुमति दी गई थी कि बोतल (नमूना) 2। सभी तीन DMSO के नमूनों के साथ बनाया पैनल का उपयोग कर Dalbavancin एमआईसी परिणाम समान और w थेस्वीकार्य क्यूसी पर्वतमाला Ithin (5 तालिका)। पी-80 के अलावा प्लास्टिक के लिए और बिना स्टॉक समाधान के प्रदर्शन के बाद dalbavancin गतिविधि के नुकसान अच्छी तरह से 7 प्रलेखित किया गया है। 2 अतिरिक्त अध्ययन, प्रारंभिक और मध्यवर्ती स्टॉक समाधान (तालिका 6) को पी-80 के अलावा और प्रारंभिक और मध्यवर्ती स्टॉक समाधान की तैयारी के लिए कांच या प्लास्टिक की ट्यूब के उपयोग में (तालिका 7) पर एक प्रभाव नहीं था dalbavancin एमआईसी का परिणाम है। तीन निर्माताओं से polypropylene और polystyrene प्लेटें (तालिका 7) का इस्तेमाल किया गया जब dalbavancin एमआईसी परिणामों पर कोई प्रभाव नहीं भी हुई थी। स्ट्रेप्टोकोक्की के परीक्षण के लिए शोरबा मीडिया में lysed घोड़े रक्त की उपस्थिति पी 80 7, 8 के लिए तुलनीय एक surfactant की तरह गतिविधि है, के लिए दिखाया गया है। स्ट्रेप्टोकोकस के लिए dalbavancin संदर्भ विधि दोनों पी 80 और lysed घोड़े रक्त शामिल करता है ,हालांकि, staphylococci और Enterococci के विपरीत, स्ट्रेप्टोकोक्की के लिए dalbavancin एमआईसी परिणामों के साथ और पी 80 के अलावा बिना (+/- 1 कमजोर पड़ने के भीतर) समान हैं। पहले से प्रस्तुत किया है और चित्र 1 में दिखाया गया है, dalbavancin अगर कमजोर पड़ने (एडी) MICS 2-8 गुना अधिक वर्तमान बीएमडी संदर्भ में 12, 13, 14 की तुलना में। बीएमडी, 0.002% के अलावा विपरीत पी 80 नहीं करता है जो आम तौर पर कर रहे हैं एमआईसी 12 परिणाम dalbavancin विज्ञापन को प्रभावित। 1 समीकरण:। 800 माइक्रोग्राम / एमएल dalbavancin समाधान के 25 मिलीलीटर के लिए Dalbavancin स्टॉक समाधान तैयारी तैयारी चरणों का उदाहरण है। विज्ञापन करने के लिए Dalbavancin और Vancomycin बीएमडी की चित्रा 1. तुलना करें। Dalbava तुलना में है कि अध्ययन के परिणामncin और vancomycin के बीएमडी और चुनिंदा ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया का वियोजन के लिए ई एमआईसी का परिणाम है। औसत (ए) Dalbavancin और (बी) 15 स्ताफ्य्लोकोच्चुस, 8 Coagulase नकारात्मक staphylococci (सीएनएस), 5 उदर faecalis और 14 और.स्त्रेप्तोकोच्ची के लिए माइक्रोग्राम / एमएल में Vancomycin रसा Microdilution और अगर कमजोर पड़ने एमआईसी परिणाम (समूह ए, बी, और सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 ए दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल; 0.06 दाल 0.12 दाल 0.25 दाल 0.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। बी दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल 0.06 दाल 0.12 दाल 0.25 दाल 0.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। सी दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल 0.06 दाल0.12 दाल 0.25 दाल 0.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। डी दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल 0.06 दाल 0.12 दाल 0.25 दाल 0.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। ए दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल 0.06 दाल 0.12 दाल 0.25 </टीडी> दाल 0.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। एफ दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल 0.06 दाल 0.12 दाल 0.25 दाल 0.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। जी दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल 0.06 दाल 0.12 दाल 0.25 दाल 00.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। एच दाल 0.002 दाल 0.004 दाल 0.008 दाल 0.015 दल 0.03 दाल 0.06 दाल 0.12 दाल 0.25 दाल 0.5 दाल 1 दाल 2 स्थिति Ctrl। दाल Dalbavancin <td> सांद्रता 50 μl / अच्छी तरह से टीका के बाद माइक्रोग्राम / एमएल में कहा गया है तालिका 1 एमआईसी थाली प्रारूप। इस वीडियो प्रकाशन में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया dalbavancin dilutions और सकारात्मक नियंत्रण कुओं में से 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप दिखा स्थान 1 2 3 4 5 6 7 8 स्रोत सान्द्र। (माइक्रोग्राम / एमएल) खंड स्रोत (एमएल) खंड DMSO (एमएल) इंटरमीडिएट सान्द्र। DMSO में (माइक्रोग्राम / एमएल) खंड इंटरमीडिएट सान्द्र। (एमएल) खंड CAMHB + 0.004% P80 * (एमएल) 2X सान्द्र। एक के बाद: CAMHB में 100 कमजोर पड़ने (माइक्रोग्राम / एमएल) अंतिम पैनल सान्द्र। पोस्ट टीका (माइक्रोग्राम / एमएल) 800 1.0 1.0 400 0.02 1.98 4 2 400 0.5 0.5 200 0.02 1.98 2 1 400 0.5 1.5 100 0.02 1.98 1 0.5 400 0.5 3.5 50 0.02 1.98 0.5 0.25 50 0.5 0.5 25 0.02 1.98 0.25 0.125 50 0.5 1.5 12.5 0.02 1.98 0.125 0.06 50 0.5 3.5 6.25 0.02 1.98 0.06 0.03 6.25 0.5 </ टीडी> 0.5 3.13 0.02 1.98 0.03 0.015 6.25 0.5 1.5 1.5 0.02 1.98 0.015 0.008 6.25 0.5 3.5 0.8 0.02 1.98 0.008 0.004 0.8 0.5 0.5 0.4 0.02 1.98 0.004 0.002 इस तालिका में CLSI M100-S25, टेबल 8B 3 से संशोधित किया गया है जल अघुलनशील रोगाणुरोधी एजेंटों की dilutions तैयारी के लिए तालिका 2. इस योजना रसा dilutions संवेदनशीलता परीक्षण में इस्तेमाल किया जाएगा। Dalbavancin काम कर समाधान और मंदक के खंड अंतिम एमआईसी की तैयारी के लिए.002-2 माइक्रोग्राम / एमएल के dalbavancin समाधान। गुणवत्ता नियंत्रण तनाव उम्मीद Dalbavancin एमआईसी (माइक्रोग्राम / एमएल) एस ऑरियस ATCC 29,213 0.03-0.12 ई faecalis ATCC 29212 0.03-0.12 एस निमोनिया ATCC 49619 0.008-.03 सुझाव उपभेदों के लिए गुणवत्ता नियंत्रण खींच 3, 11। CLSI गुणवत्ता नियंत्रण परिणामों के लिए तालिका 3. उम्मीद Dalbavancin एमआईसी परिणाम उचित पद्धति को सत्यापित करने के क्रम में नैदानिक ​​वियोजन के साथ परीक्षण किया जाना है अमरीका और यूरोपीय 2011-2013 Surveill से (प्रत्येक एमआईसी में संख्या) Dalbavancin एमआईसी परिणाम तालिका 4. वितरणमंजूरी अध्ययन 15। इन विट्रो गतिविधि में वर्तमान dalbavancin का एक संकेतक के रूप में हाल ही में नैदानिक ​​वियोजन की एक प्रकाशित अध्ययन से Dalbavancin एमआईसी का परिणाम है। # पृथक Dalbavancin एमआईसी (माइक्रोग्राम / एमएल) DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3 एस ऑरियस ATCC 29,213 0.12 0.06 0.06 0.12 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 ई faecalis ATCC 29212 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 <em> एस। निमोनिया ATCC 49619 0.015 0.015 0.015 0.03 0.015 0.015 DMSO 1 = खोले नहीं गए लौ 10 मिलीलीटर ampules सील DMSO 2 = बार-बार खोला 1L बोतल DMSO के 3 = बार-बार खोला 1L बोतल – 72 घंटे के लिए खुला बीकर में बेंच पर बैठ गया सारणी 5. Dalbavancin एमआईसी परिणाम 3 स्रोतों से DMSO के साथ DMSO के स्टॉक और इंटरमीडिएट dilutions तैयारी का उपयोग (माइक्रोग्राम / एमएल)। Dalbavancin शेयर और मध्यवर्ती dilutions की तैयारी में अलग DMSO सॉल्वैंट्स का उपयोग करने के प्रभाव की तुलना कि एक dalbavancin एमआईसी अध्ययन के परिणाम। संख्या को अलग-थलग संख्या को दोहराने Dalbavancin एमआईसी (माइक्रोग्राम / एमएल) DMSO में DALB डब्ल्यू / P80 DALB डब्ल्यू DMSO में ओ P80 / एस ऑरियस ATCC 29,213 1 0.06 0.06 2 0.06 0.06 3 0.06 0.06 4 0.06 0.06 एस ऑरियस नैदानिक ​​DP80-002SA 1 0.03 0.03 एस ऑरियस ATCC 700,699 1 0.5 0.5 एस निमोनिया ATCC 49619 1 0.03 0.015 2 0.03 0.015 3 0.03 0.015 4 0.03 0.015 एस pyogenes नैदानिक: DP80-004PY 1 0.015 0.015 DP80-005PY 1 0.03 0.03 DP80-006PY 1 0.03 0.015 DP80-007PY 1 0.06 0.03 DP80-008PY 1 0.03 0.015 एस नैदानिक ​​agalactiae: DP80-009AG 1 0.06 0.12 DP80-010AG 1 0.06 0.03 DP80-011AG 1 0.06 0.06 DP80-012AG 1 0.06 0.06 एस dysgalactiae cliniकाल DP80-013DY 1 0.03 0.03 एस नैदानिक ​​निमोनिया: DP80-014SP 1 0.06 0.06 DP80-015SP 1 0.03 0.03 DP80-016SP 1 0.03 0.03 DP80-017SP 1 0.06 0.06 साथ और 0.002% बिना DMSO के स्टॉक और इंटरमीडिएट dilutions तैयारी का उपयोग 6 तालिका Dalbavancin एमआईसी परिणाम पी-80। 0.002% पी-80 शेयर और मध्यवर्ती dilutions dalbavancin को जोड़ने के प्रभाव की तुलना कि एक dalbavancin एमआईसी अध्ययन के परिणाम। पृथक संख्या को दोहराने </टीडी> शेयर कमजोर पड़ने ट्यूब Microtiter प्लेट (प्लास्टिक प्रकार) पाली प्रोपलीन, Greiner Polystyrene कांच प्लास्टिक प्लास्टिक 1hr प्लास्टिक 1hr / इंटरमीडिएट 1hr Greiner कॉर्निंग Nunc एस ऑरियस ATCC 29,213 1 0.06 0.03 0.03 0.03 0.06 0.03 0.06 0.03 2 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.06 3 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 ई faecalis ATCC 29212 <tघ> 1 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 2 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 3 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 एस निमोनिया ATCC 49619 1 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.008 0.008 0.008 2 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.015 0.008 0.008 कांच की बोतल में बनाया कांच = प्रारंभिक शेयर, मध्यवर्ती एकाग्रता बनाने के लिए तुरंत इस्तेमालतुरंत इस्तेमाल प्लास्टिक की ट्यूब, में शोरबा dilutions बनाने के लिए। तुरंत इस्तेमाल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में किए गए प्रारंभिक = प्लास्टिक शेयर, शोरबा dilutions बनाने के लिए तुरंत इस्तेमाल प्लास्टिक की नलियों में मध्यवर्ती सांद्रता बनाने के लिए। प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में किए गए प्लास्टिक 1 घंटा = प्रारंभिक शेयर, तो शोरबा में सांद्रता बनाने के लिए तुरंत इस्तेमाल प्लास्टिक की नलियों में मध्यवर्ती सांद्रता बनाने के लिए इस्तेमाल किया 1 घंटे के लिए बेंच पर बैठते हैं। प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में किए गए प्लास्टिक 1 घंटा / इंटरमीडिएट 1 घंटा = प्रारंभिक स्टॉक है, तो, प्लास्टिक की नलियों में मध्यवर्ती सांद्रता बना तो शोरबा में सांद्रता बनाने के लिए इस्तेमाल किया 1 घंटे के लिए बेंच पर बैठ जाने के लिए इस्तेमाल किया 1 घंटे के लिए बेंच पर बैठते हैं। प्लास्टिक और कांच ट्यूब और एमआईसी प्लेट प्लास्टिक प्रकार में स्टॉक dilutions तैयारी का उपयोग टेबल 7. Dalbavancin एमआईसी परिणाम। ओ परिणामएफए dalbavancin भी microtiter प्लेट के लिए विभिन्न स्रोतों और प्लास्टिक के प्रकार के प्रयोग का असर शेयर समाधान की तैयारी कर रहा है और जब प्लास्टिक या कांच ट्यूब का उपयोग कर के प्रभाव की तुलना कि एमआईसी अध्ययन।

Discussion

dalbavancin एमआईसी के परीक्षण के लिए तैयार करते समय निम्न विधि जानकारी के अतिरिक्त विचार के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। रोगाणुरोधी एजेंटों की संख्या (यानी।, dalbavancin अकेले या एक से अधिक एजेंट) और बैक्टीरिया की प्रजातियों का परीक्षण किया जा करने के लिए परीक्षण किया जा करने पर एमआईसी पैनल के डिजाइन निर्भर करेगा। dalbavancin सांद्रता कम से कम एक क्यूसी तनाव के लिए उम्मीद का परीक्षण किया जा करने के लिए सभी प्रजातियों के जीवाणु और dilutions की पूरी श्रृंखला के लिए व्याख्यात्मक ब्रेकप्वाइंट घेरना चाहिए। रोगाणुरोधी कमजोर पड़ने श्रृंखला रोगाणुरोधी एजेंटों और / या / प्लेट और टीका की विधि आइसोलेट्स की संख्या के आधार पर पंक्तियों या स्तंभों में या तो आयोजन किया जा सकता है। dalbavancin पाउडर और शोरबा की मात्रा इष्टतम मात्रा में उत्पादन कर रहे हैं और बर्बादी कम है विश्वास दिलाता हूं कि गणना की जानी चाहिए। इस प्रकाशन में उपयोग किया जाता है उदाहरण के लिए, की मात्रा दो एमआईसी पैनलों की तैयारी पर आधारित हैं। केशन समायोजित मुलर हिंटन शोरबा आदमी के हिसाब से तैयार किया है और autoclaved होना चाहिएufacturer के निर्देशों और मीडिया के बाँझपन सत्यापित। एमआईसी के पैनल बनाया है और तैयारी के एक ही दिन पर इस्तेमाल किया है या वे उचित गुणवत्ता नियंत्रण जीवों और भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए संग्रहीत मान्य पैनल के साथ परीक्षण किया जा सकता है किया जा सकता है। यह प्रक्रिया के दौरान बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।

कॉलोनी की गिनती के साथ inoculum एकाग्रता के सत्यापन के लिए कोई सख्त मापदंड नहीं है। कॉलोनी मायने रखता 4.2 कदम में प्रदर्शन कमजोर पड़ने कदम मान्य करने के लिए समय-समय पर परीक्षण किया और / या प्रत्येक प्रजाति के लिए जाँच शुरू की जा सकती है। यह 0.5 मैकफ़ारलैंड मानक की वैधता को भी ई के साथ नियमित रूप से जाँच की है कि यह महत्वपूर्ण है 4.5 कदम करने के लिए इसी तरह की एक प्रक्रिया का उपयोग कोलाई ATCC 25922। परिणाम 1-2 एक्स 10 ⁸ CFU के बराबर नहीं कर रहे हैं / एमएल, एक नया 0.5 मैकफ़ारलैंड मानक प्राप्त किया जाना चाहिए। एमआईसी कुओं से कॉलोनी मायने रखता है स्वीकार्य सीमा के बाहर हैं, तो (क्लीनिकल अलग (एस) के लिए 2-8 एक्स 10 ⁵ सीएफयू / एमएल और एमआईसी परिणाम वें से भिन्न हैई उम्मीद सामान्य वितरण (जैसे। 0.03-0.12 यूजी / एस ऑरियस के लिए एमएल) और / या गुणवत्ता नियंत्रण को अलग (एस) के लिए एमआईसी परिणाम की उम्मीद की सीमाओं के बाहर के हैं, सत्यापन के परीक्षण के लिए आवश्यक है और विधि संशोधन warranted जा सकता है। यह एक मान्य 0.5 मैकफ़ारलैंड मानक कॉलोनी गिनती (एस) को दोहराने के लिए प्रयोग किया जाता है कि सुझाव दिया है और परिणाम की उम्मीद परिणामों के बाहर फिर से कर रहे हैं, तो 4.2 कदम में प्रदर्शन के रूप में inoculum कमजोर पड़ने के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए और एमआईसी दोहराया। कॉलोनी गिनती प्रक्रिया जरूरी दूषित जीवों की कम सांद्रता का पता नहीं लगा सकता है कि एक पतला मात्रा का उपयोग करता है क्योंकि एक कॉलोनी गिनती किया जाता है, भले ही एक शुद्धता की जांच के लिए आवश्यक है कि ध्यान दें।

एक एमआईसी परीक्षण मान्य किया जा सके, स्वीकार्य विकास अच्छी तरह से विकास नियंत्रण में होने चाहिए। Dalbavancin के खिलाफ जांच की जाएगी कि सबसे बैक्टीरिया के लिए (यानी।, Staphylococci, स्ट्रेप्टोकोक्की और Enterococci, विकास के लिए एक बटन (आमतौर> 2 मिमी) और कम fr के रूप में देखा जाएगाequently, विकास अच्छी तरह से में मलिनता के रूप में दिखाई दे सकते हैं। सांद्रता में वृद्धि के रूप में प्रभाव अनुगामी प्रदर्शन कर सकते हैं कि कुछ रोगाणुरोधी एजेंटों के विपरीत, dalbavancin समापन के आम तौर पर अच्छी तरह से परिभाषित कर रहे हैं। के रूप में लंबे समय के कुओं में विकास को विचार करने की क्षमता में कोई समझौता नहीं है के रूप में dalbavancin युक्त प्लेटों को पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो पढ़ने microdilution परीक्षण की सुविधा के लिए इरादा विभिन्न उपकरणों को देखने के, कर रहे हैं।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम dalbavancin और P80 के अलावा के घुलनशीलता से संबंधित हैं कि प्रक्रिया के कुछ हिस्सों से संबंधित हैं। यह करने से पहले शोरबा dilutions बनाने के लिए है कि DMSO के एक विलायक के रूप में प्रयोग किया जाता है और उस मध्यवर्ती सांद्रता DMSO में तैयार किए जाते हैं, का इस्तेमाल किया dalbavancin की अधिकतम एकाग्रता कोई बड़ा 1,600 से माइक्रोग्राम / एमएल है कि यह महत्वपूर्ण है कि इतने एमआईसी में DMSO के अंतिम एकाग्रता पैनल कुओं में 1% से अधिक है। DMSO हीड्रोस्कोपिक है और इसलिए, DMSO के पुराने बोतलों का उपयोग एक की बातों थाdalbavancin घुलनशीलता के संबंध में आयन। गुणवत्ता नियंत्रण उपभेदों के साथ एक छोटे से बीएमडी अध्ययन यह दिखाया गया है, जबकि हालांकि, (परिणाम अनुभाग देखें) एक महत्वपूर्ण चर होने के लिए नहीं है, यह DMSO के नए या हाल ही में खोला बोतलों का उपयोग करने के लिए अच्छा अभ्यास है। यह P80 दवा कमजोर पड़ने तैयारी के अंतिम चरण में शोरबा में जोड़ा जाता है कि यह भी महत्वपूर्ण है और अच्छी तरह से एमआईसी में 0.002% की एक अंतिम एकाग्रता में है।

बीएमडी प्रक्रिया यहाँ शामिल अच्छी तरह से dalbavancin और पी 80 सांद्रता दो बार अंतिम एकाग्रता और 50 μl साथ inoculum के अलावा में / इतनी अच्छी तरह से अंतिम मात्रा / अच्छी तरह से 100 μl है कि 50 μl / उपयोग करते हुए एमआईसी पैनलों की तैयारी का इस्तेमाल करता है। एक एमआईसी पैनल प्रारूप दोनों एस के परीक्षण के लिए उत्पादन किया जा करने के लिए इस विधि की अनुमति देता है ऑरियस और एस निमोनिया lysed घोड़े रक्त inoculum में जोड़ा जा सकता है। 100 μl / अच्छी तरह से करने के लिए 10 μl के अलावा का उपयोग करते हुए एमआईसी पैनलों की तैयारी के लिए वैकल्पिक तरीकों / अच्छी तरह से वर्णित हैंCLSI और आईएसओ प्रक्रियाओं।

एस के लिए dalbavancin अतिसंवेदनशील ब्रेकप्वाइंट ऑरियस ≤0.12 माइक्रोग्राम / एमएल (एफडीए पैकेज डालने) है। हाल ही में निगरानी में दिखाया गया है, वियोजन के बहुमत 0.06 माइक्रोग्राम / एमएल ¹⁵ के स्तर पर dalbavancin से हिचकते हैं। करीब मोडल एमआईसी के लिए एक अतिसंवेदनशील ब्रेकप्वाइंट के साथ, विधि मतभेद का एक परिणाम के रूप में एमआईसी में किसी भी बदलाव के लिए संवेदनशीलता दरों को प्रभावित कर सकते हैं। Dalbavancin के लिए बीएमडी प्रक्रिया (कुछ अनूठे कदम भी शामिल है क्योंकि विशेष रूप से, अच्छी तरह से एमआईसी में शेयर और मध्यवर्ती दवा dilutions और 0.002% P80 की तैयारी में DMSO के उपयोग, यह विधि बिल्कुल पीछा किया जाता है कि जरूरी है। एस ऑरियस क्यूसी जीव 0.06 माइक्रोग्राम / एमएल के एक बहुत ही स्पष्ट dalbavancin मोडल एमआईसी के साथ (ATCC 29,213), विधि भिन्नता का एक अच्छा संकेत दिया गया है और बीएमडी विधि मान्य करने के लिए नियमित रूप से इस्तेमाल किया जाना चाहिए। एमआईसी परिणाम 0.03-0.12 ग्राम की उम्मीद है और सीमा के साथ कर रहे हैं / मिलीलीटर, लेकिन या तो कम या hig के लिए रुझानइस श्रृंखला की ज ओर, विधि के आगे सत्यापन warranted है।

0.002% P80 के अलावा सभी प्रासंगिक ग्राम पॉजिटिव जीवों के लिए सिफारिश की है (staphylococcci, Enterococci, और.स्त्रेप्तोकोच्ची।) हालांकि, यह है कि यह बाध्यकारी विरोधी अपने को पी-80 रिश्तेदार के समान कार्य करता है घोड़े रक्त lysed दिखाया गया है कि उल्लेखनीय है कि क्षमता और + एलएचबी dalbavancin स्ट्रेप्टोकोक्की एमआईसी परिणामों पर कोई अतिरिक्त प्रभाव पड़ता है CAMHB करने के लिए पी-80 के अलावा हैं।

वहाँ परीक्षण dalbavancin के लिए कोई डिस्क प्रसार विधि वर्तमान में है और क्योंकि गरीब बीएमडी के सहसंबंध और विज्ञापन के परिणाम, ई विधि का उपयोग dalbavancin की संवेदनशीलता परीक्षण की ^{12, 14} की सिफारिश नहीं है। बीएमडी विधि dalbavancin संवेदनशीलता के भविष्य के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और वाणिज्यिक रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के विकास के लिए एक स्वर्ण मानक के रूप में।

Materials

Dalbavancin	Metrics, Inc.	Greenville, NC	BI-397
Vancomycin	Sigma-Aldrich	St. Louis, MO	C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth	Becton Dickinson	Sparks, MD	212322
Lysed horse blood	Cleveland Scientific	Bath, OH
Dose-it peristaltic pump	Integra Biosciences	Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II)	Integra	Hudson, NH	4164
12 channel pipet (Matrix)	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL)	VistaLab	Brewster, NY
96 well microplate	Greiner Bio-one	Monroe, NC	650161
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16x125mm disposable glass tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
12x17mm snap cap, polystyrene tubes	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
16 mL centrifuge tubes	BioExpress	Kaysville, UT	C-3394-2
Reagent reservoirs	Integra Biosciences	Hudson, NH	4312
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL)	Biologix	Lenexa, KA	65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood	Becton Dickinson	Sparks, MD
Incubator (ambient)	Sanyo
Incubator (5% CO2)	Sanyo
Analytical balance	ThermoFisher Scientific	Waltham, MA
Gloves	Kimberly-Clark		52817
Lab coats