Molekylær Probe Optimering konstateres Cell Dødelighed i en Fotosyntetisk Organisme (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Under anvendelse af flowcytometri

Summary

Mikrobielle populationer indeholder væsentlig celle heterogenitet, som kan diktere den samlede adfærd. Molekylær sonde analyse gennem flowcytometri kan bestemme fysiologiske tilstande af celler, men dens anvendelse varierer mellem arter. Denne undersøgelse giver en protokol til nøjagtigt at bestemme celle dødelighed inden for en cyanobakterie befolkning, uden at undervurdere eller optagelse falske positive resultater.

Abstract

Mikrobielle subpopulationer i marken og laboratorieundersøgelser har vist sig at vise høj heterogenitet i morfologiske og fysiologiske parametre. Bestemmelse af tidstro tilstand af en mikrobiel celle går ud over levende eller døde kategorier, som mikroorganismer kan eksistere i en sovende tilstand, hvor celledeling og metaboliske aktiviteter er reduceret. På grund af behovet for detektion og kvantificering af mikrober, flowcytometri (FCM) med molekylære sonder giver en hurtig og præcis metode til at hjælpe med at bestemme den samlede befolkning levedygtighed. Ved at bruge SYTOX Green og SYTOX Orange i modellen cyanobakterier Microcystis aeruginosa at opdage membranintegritet, vi udvikler et overdrages metode til hurtig indikation af enkelt dødelighed celle. De molekylære prober anvendes inden dette tidsskrift, vil blive omtalt som grønne eller orange nukleinsyreprober henholdsvis (selv om der er andre produkter med lignende excitations- og emissions- bølgelængder, der har en tilsvarende former for action, vi specifikt henvises til i forgrunden nævnte sonder). Protokoller der anvender molekylære sonder varierer mellem arterne, adskiller hovedsagelig i koncentrations- og inkubationstider. Efter denne protokol er fastsat på M.aeruginosa den grønne nukleinsyreprobe blev optimeret ved koncentrationer på 0,5 uM efter 30 minutters inkubation, og den orange nukleinsyreprobe på 1 uM efter 10 min. I begge prober koncentrationer mindre end den angivne optimal ført til en under rapportering af celler med skader membran. Omvendt 5 pM koncentrationer og højere i begge sonder udviste en form for ikke-specifik farvning, hvorved 'live' celler produceret et mål fluorescens, hvilket fører til en over repræsentation af "ikke-levedygtige 'celletal. De positive kontroller (varme-dræbt) forudsat testbare døde biomasse, selv om det hensigtsmæssige i kontrol generation er fortsat genstand for debat. Ved at demonstrere en logisk sekvens af trin til optimering af de grønne og orange nukleinsyreprober vi demonstrate hvordan man skaber en protokol, som kan anvendes til at analysere cyanobakteriel fysiologiske tilstand effektivt.

Introduction

Cellen er et komplekst system, der konstant reagerer på miljøet ved at modificere fysiologiske parametre og ændre dets funktion. Populationsdynamik af isogene mikrobielle populationer både i naturen og laboratorium påvirkes af udviklingen af subpopulationer, der forekommer selv under forholdsvis konstante miljøforhold ^{1 – 3.} Variabiliteten af ​​naturlige mikrobielle samfund opstår på grund af den meget varierende natur miljøforhold. Disse tider stokastiske processer efterfølgende producerer subpopulationer, der er meget anderledes end gennemsnittet af befolkningen. De seneste oplysninger har vist, at disse fysiologiske delpopulationer reagerer forskelligt på miljøforhold og kan producere signal forbindelser eller inhibitorer, der dramatisk indflydelse og påvirke den samlede befolkning ^3,4.

Etablering af en metode til at definere heterogenitet inden for en population er nøglen til unståelse økologi mikrober i forskellige miljøer og er afgørende, når man bygger viden om gener cyanobakterier, såsom giftige Microcystis, som påvirker tungt på menneskelig vandsikkerhed. arter såsom Anabaena vise morfologiske heterogenitet som reaktion på miljømæssige udsving, udvikle specialiserede celler som heterocysts og akinetes ^2. I modsætning hertil Microcystis celler ikke vise indlysende morfologiske heterogenitet under en stress-respons. Forskelsbehandlingen mellem levedygtige og ikke-levedygtige celler er det vigtigste aspekt af fysiologisk differentiering og tillader en bedre forståelse af mikrobielle populationsdynamik. Er dog stadig svært og dårligt karakteriseret ^1,5,6 den konceptuelle problem med bakteriel levedygtighed selv.

Flowcytometri (FCM) er en pålidelig og hurtig fremgangsmåde til analyse af enkelte celler. For at øge forståelsen af ​​enkelt celle fysiologi gennem FCM, er blevet anvendt molekylære prober til at skelne et antal metaboliske og biokemiske processer ^7. Dette har ført til øget viden om arter på et cellulært og befolkningsniveau og til gengæld hjalp vandressourceforvaltning ^8,9. Men organismer forskellige med hensyn til molekylær sonde optagelse og udstrømning grund porerne og pumper i cellevæggene og membraner, som har ført til en række molekylær sonde design og implementering af protokol ^6,10,11. Molekylære sonder til rådighed for kommercielle og forskningsformål leveres ofte med en generisk protokol, som kan være gældende for en meget anderledes celletype. Man skal være meget forsigtig med at overføre protokoller udviklet til en celle til en anden ^6, er det derfor en væsentlig opgave at optimere molekylære prober effektivt før brug.

De grønne og orange nukleinsyreprober binder til både dobbelt- og enkeltstrengede nucleinsyrer med minimal BASEVALGcering og anvendes til at vurdere plasmamembranintegritet af celler. Den grønne nukleinsyreprobe har en markant forbedret cellemærkning fluorescenssignal i forhold til andre molekylære prober, såsom propidiumiodid-baserede forbindelser ^12, som også kan virke som en indikator for cellelevedygtighed. Udtrykket "cellelevedygtighed" her ud fra, at DNA-nedbrydning sker efter tabet af plasmamembranintegritet. De nukleinsyreprober usymmetriske cyaninfarvestoffer med tre positive ladninger og kan ikke trænge ind i celler med intakte membraner under karakteriseret koncentrationer, både eukaryote og prokaryote ^{11,13 14,15} organismer. Bindingen af ​​en nukleinsyreprobe til nukleinsyrer kan resultere i op til en> 500 gange forøgelse af fluorescens-emissioner fra endogene signaler i celler, der har deres membran integritet kompromitteres. Selv molekylære prober såsom den grønne nukleinsyreprobe kan være en god indikator for enkelt celle fysiologi, der er behov to optimere hver probe med den tilsigtede målorganismen, som inkubationstider har varieret fra 7 min – 30 min og koncentrationsintervaller fra 0,1 pM – 0,5 pM i Microcystis eksperimenter alene ^15-19.

Her præsenterer vi en protokol til at optimere cytometriske analyser af grøn og de ​​relativt nye appelsin nukleinsyreprober (som til dato ikke er blevet testet på de cyanobakterielle arter M.aeruginosa). Følgende udviklede metode kan derefter overføres til andre arter og anvendes som platform til optimering protokoller i andre molekylære prober og derved øge forståelsen af ​​mikrober og deres økologiske adfærd.

Protocol

1. Forberedelse af Molekylær Probe og Flow Cytometer Fortynd stamopløsninger af nukleinsyreprober, der leveres som en 5 mM opløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) til portioner af passende koncentrationer i ultrarent filtreret H 2 O. Opbevar nukleinsyreprober i mørke omgivelser mellem -5 ° C og – 25 ° C indtil anvendelse. Tænd flowcytometeret og belastning softwarepakke (se tabel Materialer / Udstyr til FCM specifikationer). Placer en tom hæmo…

Representative Results

Frontal lysspredning (FSC) og side lysspredning (SSC) udgange fra en M.aeruginosa batch-kultur i eksponentiel fase indeholder oplysninger om cellestørrelse (diameter) og intern granularitet (figur 1A). FSC kan skelne celler, som er for store og / eller små til at være M.aeruginosa. Denne diskrimination eller gating kan gøres ved raffinering data mellem visse punkter i et FSC output (figur 1C). Phycocyanin, en stor forfatning M.a…

Discussion

De øgede antal publikationer gennem molekylære sonder viser, at pålidelige og informative data kan fås ^{5,6,8 – 15,19,22,23.} Som i endnu er der ingen perfekte pletten for celle levedygtighed, der kan være effektiv på tværs af alle arter med samme koncentration og inkubationstid ^6,10. Selv den samme type probe med ændrede fluorescens-emissioner viser et behov for at etablere den korrekte koncentration og inkubationstid (tabel 1 og 3). Som det ses ved bru…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO