Fotodynamische therapie met Blended geleidend polymeer / Fullerene Nanodeeltje Fotosensitizers
Summary
This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).
Abstract
In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.
Introduction
Bij fotodynamische therapie (PDT) fotosensibilisatoren worden toegediend aan doelweefsel en na blootstelling aan het fotosensibiliserende licht genereert Reactive Oxygen Species (ROS). ROS soorten zoals singlet zuurstof en superoxide kan oxidatieve stress en daaropvolgende structurele schade aan cellen en weefsels 1-4 induceren. Vanwege het gemak van de toepassing van deze methode is actief onderzoek en klinische studies hebben plaats 5,6 genomen. Echter, belangrijke zaken als donkere toxiciteit van de sensibilisatoren, patiënt gevoeligheid voor licht (door niet-selectieve distributie van de sensibilisator) en hydrofobiciteit van de sensibilisatoren (wat leidt tot verminderde biologische beschikbaarheid en de potentiële acute toxiciteit) blijven.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het vervaardigen en in-vitro evaluatie van geleidend polymeer nanodeeltjes gemengd met fullereen als de volgende generatie fotosensibiliserende voor PDT. De nanodeeltjes worden gevormd door zelf-aggregatie vanhet halfgeleidende polymeer MEH-PPV (poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenyleenvinyleen]) met het fullereen PCBM (fenyl-C 61 -boterzuur methylester) wanneer deze materialen opgelost in een compatibele oplosmiddel snel geïnjecteerd in een niet-compatibele solvent (Figuur 1A). De keuze van MEH-PPV als de gastheer polymeer wordt gemotiveerd door zijn hoge extinctiecoëfficiënt die leidt tot hoge prijzen van triplet formatie en efficiënt en ultrasnel lading en energieoverdracht aan de fullereen PCBM 7. Deze eigenschappen zijn ideaal voor sensibilisering van singlet zuurstof en superoxide formatie in PDT.
Fullereen is in feite is toegepast in PDT in zowel de moleculaire en nanodeeltjes vorm 8-13. Echter, heeft ernstige cytotoxiciteit verdere ontwikkeling 12 belemmerd. Hier laten we zien dat het inkapselen van het fullereen in een gastheer matrix van MEH-PPV om composiet MEH-PPV / PCBM nanodeeltjes resultaten op in een PDT sensibiliserend materiaal dat iis niet intrinsiek cytotoxische, toont specificiteit voor kankercellen te wijten aan nanodeeltjes grootte en oppervlakte lading, en de opbrengsten zeer effectieve PDT behandeling bij weinig licht doses als gevolg van de eerder genoemde fotofysische eigenschappen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om nanodeeltjes opname te bereiken is het noodzakelijk om een aantal cruciale maatregelen te handhaven was, terwijl het vervaardigen van de nanodeeltjes. Een 10 -6 M MEH-PPV oplossing (gemengd met 50 gew% PCBM) in THF werd bereid injecteren in DI water, zoals werd waargenomen dat de concentratie van deze oplossing speelt een belangrijke rol bij het bepalen van de grootte van nanodeeltjes gevormd. Concentratie werd gecontroleerd met UV-vis spectroscopie. Merk op dat in stap 2.1.3 protocol diende de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the National Science Foundation (NSF) for financial support of this work through a CAREER award (CBET-0746210) and through award CBET-1159500. We would like to thank Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) and Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) for assistance with cell culture.
Materials
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | > 99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1X 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).
- Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).
- Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6 (3), 817-840 (2013).
- Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology – Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).
- Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).
- Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9 (4), 613-621 (2013).
- Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).
- Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).
- Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).
- Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).
- Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).
