Das Studium von Proteinfunktionen und die Rolle der Altered Protein Expression von Antikörper-Interferenz und Dreidimensionale Rekonstruktionen

Zusammenfassung

Die Kontrolle der Proteinexpression ist nicht nur für jeden lebenden Organismus unerlässlich, sondern auch eine wichtige Strategie, um Proteinfunktionen in zellulären Modellen zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll zeigt die Anwendung von Antikörperinterferenzen in Säugetierzellen, einschließlich primärer Hippocampus-Neuronen, und demonstriert die Verwendung dreidimensionaler Rekonstruktionen bei der Untersuchung der Proteinfunktion.

Zusammenfassung

Eine strenge Verwaltung der Proteinexpression ist nicht nur wichtig für jeden Organismus am Leben, sondern auch eine wichtige Strategie Proteinfunktionen in Zellmodellen zu untersuchen. Daher erfunden neuere Forschung verschiedene Werkzeuge Proteinexpression in Säugetierzelllinien oder Tiermodellen, einschließlich RNA und Antikörper Interferenz abzuzielen. Während die erste Strategie viel Aufmerksamkeit in den letzten zwei Jahrzehnten gesammelt hat, Peptide, die eine Translokation von Antikörper Cargos durch Zellmembranen und in Zellen vermitteln, erhalten viel weniger Interesse. In dieser Publikation stellen wir ein detailliertes Protokoll, wie ein Peptidträger namens Chariot in humanen embryonalen Nierenzellen sowie in primären Neuronen im Hippocampus zu nutzen, um Antikörper Interferenzexperimente durchführen und weiter die Anwendung von dreidimensionalen Rekonstruktionen bei der Analyse von Protein-Funktion veranschaulichen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Chariot ist, wahrscheinlich aufgrund seiner Kernlokalisationssignal, particularly gut geeignet Proteine ​​im soma und den Kern mit Wohnsitz Ziel. Bemerkenswert ist, wenn Chariot zu primären Hippokampus-Kulturen anwenden, wandte sich das Reagenz überraschend gut aus von dissoziierten Neuronen in Kauf genommen werden.

Einleitung

Eine strenge Kontrolle der Proteinexpression ist für jeden lebenden Organismus seine eigene Entwicklung als auch zu befehlen, als auf Umweltsignale zu reagieren. Daher wurde eine Vielzahl von Mechanismen erfunden während der Evolution genau das Expressionsniveau jedes von dem App kodierten Proteins regulieren. 20.000 Gene in jeder eukaryotischen Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt ihres Lebens existiert. Es findet in den verschiedenen Phasen der Proteinproduktion reichen die Regulationsmechanismen aus dem Management der Chromatinstruktur, Transkription und RNA auf die Richtung der posttranslationalen Proteinmodifikationen Handhabung, Transport und Abbau.

Protokoll

1. Stammlösungen

1. Resuspendieren des lyophilisierten aktiven Motiv Pulver in sterilem H ₂ O auf eine Endkonzentration von 2 ug / ul. Tippen Sie vorsichtig zum Mischen.
2. Bereiten Sie kleine Teilmengen ( zum Beispiel 12 & mgr; l jeweils 2 ul pro Reaktion benötigt werden) und speichern sie bei -20 ° C.

2. Herstellung von Zellen

1. Seed Säugerzellen wie HEK293-Zellen oder primären Neuronen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen in 500 & mgr; l Wachstumsmedium mit Antibiotika.
   HINWEIS: Wenn Neuronen verwenden, die Zellen bei geringer Dichte Saatgut und verwenden Sie nur die beiden mittl....

Ergebnisse

In den folgenden Abschnitten wird eine funktionale Zuschlags eines POI exemplarische Ergebnisse (Simiate, für weitere Details siehe bitte ^{16, 17)} darstellt , unter Verwendung von Chariot Reagenz und Antikörper Interferenz präsentiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass verminderte Expression von Simiate Transkriptionsaktivität beeinträchtigt, und in einer dosisabhängige Weise, induziert Apoptose, die ihren Höhepunkt in Mortalitätsraten von über 99%, wenn höhere Antikörper-Mengen (> 1 .......

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll die Bedeutung von Protein-Expressionsniveaus in Kontrolle zellulärer Funktionen in einer Dosis angetrieben Weise zu studieren. Das beschriebene Protokoll ermöglicht eine Feinabstimmung Manipulation der Proteinexpression in verschiedenen Säugetierzelltypen, einschließlich Hippocampusneuronen, damit detaillierte Studien der Proteinfunktion auf zellulärer Ebene zu erleichtern.

Obwohl die RNA - Interferenz eine bekannte Strategie POIs repräsentiert herunterregulier.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chariot	Active Motif	30025	bei -20 > C
Neurobasales Medium	Lebenstechnologien	21103-049	erwärmen sich auf 37 > C vor der Verwendung von
1x B27		Life-Technologien 17504044	bei -20 & Grad lagern; C
L-Glutamin	Life Technologies	25030-149	lagern bei -20 ° C
Penicillin und Streptomycin	Life technologies	15140-122	lagern bei -20 ° C
Imaris Software	Bitplane	n.a.teur,	aber unübertroffen
Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	n.a.