El estudio de la función de proteínas y el Papel de la expresión de la proteína alterada por la interferencia de anticuerpos y reconstrucciones tridimensionales

Summary

Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.

Abstract

Una gestión estricta de la expresión de proteínas no sólo es esencial para todos los organismos vivos, sino también una estrategia importante para investigar las funciones de proteínas en modelos celulares. Por lo tanto, la investigación reciente inventado diferentes herramientas para dirigir la expresión de proteínas en líneas de células de mamífero o incluso modelos animales, incluyendo ARN y la interferencia de anticuerpos. Mientras que la primera estrategia ha recogido mucho la atención durante las últimas dos décadas, los péptidos que median una translocación de cargas de anticuerpos a través de las membranas celulares y en las células, obtuvieron mucho menos interés. En esta publicación, se proporciona un protocolo detallado cómo utilizar un portador de péptido llamado Chariot en células de riñón de embriones humanos, así como en las neuronas del hipocampo primarias para llevar a cabo experimentos de interferencia de anticuerpos y ilustrar adicionalmente la aplicación de las reconstrucciones en tres dimensiones en el análisis de la función de proteínas. Nuestros hallazgos sugieren que Chariot es, probablemente debido a su señal de localización nuclear, particularly bien adaptado a proteínas diana que residen en el soma y el núcleo. Sorprendentemente, cuando se aplica a cultivos de hipocampo Chariot primarios, el reactivo resultó ser sorprendentemente bien aceptado por las neuronas disociadas.

Introduction

Un control estricto de la expresión de la proteína es esencial para todos los organismos vivos para comandar su propio desarrollo, así como para reaccionar a las señales ambientales. Por lo tanto, una multitud de mecanismos se ha inventado durante la evolución de regular con precisión el nivel de expresión de cada proteína codificada por la aplicación. 20.000 genes existentes en cualquier célula eucariota en un momento dado de su vida. Que tienen lugar en diferentes etapas de la producción de proteínas, los mecanismos de regulación van desde la gestión de la estructura de la cromatina, la transcripción y ARN manipulación a la dirección de las modificaciones posteriores a la traducción de proteínas, el transporte y la degradación.

Por lo tanto, no es sorprendente que el mal funcionamiento de los mecanismos moleculares y los niveles de expresión de proteína alterada subyacente se han asociado con diversas enfermedades como el cáncer o discapacidad intelectual. De hecho, mirando a la complejidad excepcional del desarrollo neuronal y la función del cerebro de los mamíferos, el Sensitividad de estos sistemas sofisticados a alteraciones en la expresión de la proteína se manifiesta en varios déficits intelectuales bien conocidos que incluyen la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson (AD y PD), así como los trastornos del espectro autista (TEA) como el Síndrome X Frágil (SXF). Esta última enfermedad se caracteriza por una extensa misexpression de una variedad de proteínas, que se debe a la pérdida de una sola proteína traducción regulación, FMRP (Frágil proteína Retraso Mental X) ^1-4. Proteína Además, reordenamientos cromosómicos que afectan a la carga variable ligada al cromosoma X A (VCXA), una proteína, que administra la estabilidad del ARNm y la traducción mediante la modificación de ARNm de tapado ^5, recientemente se han asociado con déficits intelectuales, mientras que las mutaciones puntuales no fueron identificados en pacientes con discapacidad cognitiva a partir de ahora ^{6, 7,} lo que sugiere que los deterioros mentales observados originan a partir de la expresión VCXA alterada y la expresión desregulada de su prote objetivoins. De acuerdo con estos hallazgos, un estudio que investiga si novo copia variaciones en el número de genes que están asociados con TEA estableció que los nuevos genes duplicaciones y deleciones son un factor de riesgo significativo para ASD ^8, lo que apoya la idea de que los niveles de proteína de expresión elevados o disminuidos pueden causar déficit intelectual.

Sorprendentemente, las investigaciones recientes proporcionan evidencia adicional de que el nivel de expresión de una proteína dada se ajusta con precisión para evitar su agregación como consecuencia de cantidades elevadas de proteínas casi sin márgenes de seguridad ^9. Por lo tanto, se ha propuesto que incluso pequeños incrementos son suficientes para inducir enfermedades tales como AD y PD ^9. A pesar de la variedad de los mecanismos moleculares que contribuyen al control de la expresión de proteínas sugiere un esquema de regulación compleja a la luz de estos hallazgos, un estudio que investiga el nivel de expresión de más de 5.000 genes de mamíferos demostró que ¹⁰la naturaleza prefiere un esquema más parsimoniosa: La abundancia celular de las proteínas ha demostrado ser regulada principalmente a nivel de la traducción ^10, ilustrando así que la gestión de la disponibilidad de ARN sirve principalmente para afinar la expresión de proteínas.

El estudio de la dosis de proteínas de interés (POI), por tanto, no sólo es importante para la comprensión de las funciones endógenas de una proteína, sino también para la investigación de muchas enfermedades y el desarrollo de terapias. Por lo tanto, últimas décadas han visto el avance de varias estrategias utilizando ARN de interferencia para manipular la dosis PDI. Aunque la interferencia de ARN se utiliza ampliamente para estudiar la función de la proteína e incluso está siendo aplicado en los ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer o enfermedades oculares, así como para seguir las terapias antivirales en pacientes ^11-13, algunos pueden surgir dificultades que podrían hacer que la estrategia imposible. Por ejemplo, la secuencia de semillas, que impulsa la caída por homología es comparativamentebles efectos a corto, por lo tanto, promueven desviado. Como las secuencias altamente eficientes son raros y hay que encontrar entre miles de opciones (revisado en ^14), la identificación de la secuencia correcta puede ser lento y costoso, pero los resultados pueden todavía ser decepcionante.

Una estrategia alternativa es dirigirse directamente al PDI por anticuerpos. A continuación, se ilustra el uso del carro portador de proteína (fabricado por Active Motif) para reducir la disponibilidad de proteínas celulares, y el empleo de las reconstrucciones tridimensionales para estudiar la función de proteínas después de knock-down.

El motivo activa de Chariot, en sí misma un péptido de 2,8 kDa, se utiliza para los péptidos de transporte, proteínas y anticuerpos a través de membranas de células de mamíferos ^15. Los asociados de péptidos con PDI que puede formar junto no covalentes complejos macromoleculares que utilizan las interacciones hidrofóbicas, con lo cual los complejos Chariot-PDI se internalizan en las células en un endosoma-independent manera. Es importante destacar que, Chariot se indicó que era ni afectar a la localización intracelular de las proteínas transportados, ni que ejercen efectos citotóxicos o para afectar la actividad biológica de su carga ^15.

Protocol

1. Soluciones de archivo Resuspender el polvo motivo activo liofilizado en H2O estéril a una concentración final de 2 mg / l. Golpee suavemente para mezclar. Preparar alícuotas pequeñas (por ejemplo, 12 l cada uno, se requieren 2 l por reacción) y almacenar a -20 ° C. 2. Preparación de células De semillas de células de mamífero tales como células HEK293 o neuronas primarias en un medio de crecimiento placa de 24 pocillos en…

Representative Results

En los párrafos siguientes, los resultados de ejemplo que ilustran una caída funcional de un POI (Simiate, para más detalles, véase 16, 17) usando el reactivo Chariot y la interferencia de anticuerpos se presentan. Los resultados demuestran que la disminución de la expresión de Simiate deteriora la actividad transcripcional, y, en una forma dependiente de la dosis, induce la apoptosis, que culmina en las tasas de mortalidad de más del 99% si se aplican cantidades de anticuerpos m?…

Discussion

A continuación, se presenta un protocolo para estudiar la importancia de los niveles de expresión de proteínas en el control de las funciones celulares de una manera impulsada dosis. El protocolo descrito permite una manipulación afinado de expresión de la proteína en varios tipos de células de mamíferos, incluyendo las neuronas del hipocampo, por lo tanto, facilitar los estudios detallados de función de la proteína en el nivel celular.

A pesar de la interferencia de ARN representa…

Materials

Chariot	Active Motif	30025	store at -20°C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	warm up to 37°C before using
1xB27	Life technologies	17504044	store at -20°C
L-glutamine	Life technologies	25030-149	store at -20°C
Penicilline and Streptomycine	Life technologies	15140-122	store at -20°C
Imaris software	Bitplane	n.a.	expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope	Zeiss	n.a.