Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.
Una gestione rigorosa di espressione della proteina è essenziale non solo per ogni organismo vivo, ma anche una strategia importante per indagare le funzioni delle proteine in modelli cellulari. Pertanto, una recente ricerca ha inventato diversi strumenti per indirizzare l'espressione della proteina in linee cellulari di mammifero o anche modelli animali, tra cui l'RNA e l'interferenza degli anticorpi. Mentre la prima strategia ha raccolto molta attenzione nel corso degli ultimi due decenni, i peptidi che mediano una traslocazione dei carichi di anticorpi attraverso le membrane cellulari e nelle cellule, ottenute molto meno interesse. In questa pubblicazione, fornendo un protocollo dettagliato come utilizzare un vettore peptide chiamato Chariot in cellule renali embrionali umane come in neuroni ippocampali primari eseguire esperimenti di interferenza anticorpale e illustrano ulteriormente l'applicazione di ricostruzioni tridimensionali per analizzare la funzione delle proteine. I nostri risultati suggeriscono che Chariot è, probabilmente a causa del suo segnale di localizzazione nucleare, particularly ben adatto a bersaglio le proteine che risiedono nel soma e il nucleo. Sorprendentemente, quando si applica Chariot alle culture ippocampali primarie, il reagente si rivelò essere sorprendentemente ben accettato dai neuroni dissociati.
Una stretto controllo dell'espressione della proteina è essenziale per ogni organismo vivente per comandare il proprio sviluppo e di reagire a segnali ambientali. Pertanto, un gran numero di meccanismi è stato inventato durante l'evoluzione di regolare con precisione il livello di espressione di ogni proteina codificata dal app. 20.000 geni esistenti in qualsiasi cellula eucariotica in un dato momento della sua vita. Che si svolgono in diverse fasi della produzione di proteine, meccanismi regolatori spaziano dalla gestione della struttura della cromatina, trascrizione e RNA movimentazione alla direzione di modificazioni post-traduzionali di proteine, trasporto e degradazione.
Non è quindi sorprendente che i disturbi del macchinari molecolari e livelli di espressione della proteina alterata sottostante sono stati associati con malattie diverse come il cancro o disabilità intellettiva. In effetti, guardando l'eccezionale complessità dello sviluppo neuronale e la funzione del cervello dei mammiferi, la Sensitività di questi sistemi sofisticati ad alterazioni nel espressione della proteina si manifesta in diversi deficit intellettuali ben noti, tra cui Alzheimer e morbo di Parkinson (AD e PD), così come disturbi dello spettro autistico (ASD) come la sindrome dell'X fragile (FXS). Quest'ultima malattia è caratterizzata da una vasta misexpression di una varietà di proteine, che è dovuto alla perdita di una singola definizione regolazione proteine, FMRP (fragile X ritardo mentale Protein) 1-4. Inoltre, riarrangiamenti cromosomici che interessano la carica variabile legata all'X proteina A (VCXA), una proteina, che gestisce la stabilità mRNA e la traduzione modificando mRNA tappatura 5, sono state recentemente associate a deficit intellettivi, mentre mutazioni puntiformi non sono state identificate nei pazienti con disabilità cognitive fin d'ora 6, 7, il che suggerisce che i disturbi mentali osservati provengono da espressione VCXA alterata e l'espressione disregolazione della sua prote bersaglioins. In linea con questi risultati, uno studio che ha valutato se de novo copia variazioni del numero di geni sono associati con ASD stabilito che duplicazioni di geni nuovi e delezioni sono un fattore di rischio significativo per ASD 8, sostenendo in tal modo l'idea che i livelli di espressione della proteina elevati o diminuiti possono causare deficit intellettuali.
Sorprendentemente, recenti ricerche hanno fornito ulteriore prova che il livello di espressione di una data proteina è regolata con precisione per prevenire l'aggregazione in conseguenza di elevate quantità della proteina con quasi senza margini di sicurezza 9. È stato quindi proposto che anche piccoli incrementi sono sufficienti ad indurre malattie come AD e PD 9. Sebbene la varietà di macchinari molecolari che contribuiscono al controllo espressione della proteina suggerisce uno schema regolazione complessa alla luce di questi risultati, uno studio che ha il livello di espressione di oltre 5.000 geni di mammifero 10 dimostrato chela natura ha preferito uno schema più parsimoniosa: L'abbondanza cellulare di proteine ha dimostrato di essere in prevalenza regolato a livello della traduzione 10, illustrando in tal modo che la gestione della disponibilità di RNA serve soprattutto per mettere a punto l'espressione della proteina.
Studiando la dose di proteine di interesse (POI) è quindi importante non solo per la comprensione delle funzioni endogene di una proteina, ma anche alla ricerca di molte malattie e lo sviluppo di terapie. Così, negli ultimi decenni hanno visto l'avanzata delle diverse strategie utilizzando RNA interferenza di manipolare dosaggio POI. Anche se l'interferenza dell'RNA è ampiamente usato per studiare la funzione delle proteine e viene anche applicata in studi clinici per il trattamento di cancro o di malattie oculari, nonché a perseguire terapie antivirali nei pazienti 11-13, alcune difficoltà possono sorgere che potrebbero rendere la strategia di impossibile. Ad esempio, la sequenza seme, che spinge il colpo per omologia è comparabilitàeffetti a breve, quindi la promozione fuori bersaglio bile. Dal momento che le sequenze altamente efficienti sono rari e hanno bisogno di essere trovato tra migliaia di opzioni (rivisto nel 14), identificando la sequenza giusta può richiedere molto tempo e costoso, ma i risultati possono ancora essere deludente.
Una strategia alternativa è quello di colpire direttamente il POI da anticorpi. Qui, illustriamo l'uso del Carro proteina carrier (prodotto da Active Motif) per ridurre la disponibilità proteina cellulare, e l'impiego di ricostruzioni tridimensionali per studiare la funzione della proteina seguente knock-down.
Il motivo attivo di carro, per sé un 2,8 kDa peptide, viene utilizzato per peptidi navetta, proteine e anticorpi attraverso le membrane delle cellule di mammifero 15. I soci peptide con POI formando non covalente accoppiato complessi macromolecolari che utilizzano interazioni idrofobiche, dopo complessi Chariot-POI vengono internalizzati nelle cellule in un endosome-indmaniera ependent. Importante, Chariot stato indicato per non pregiudicare la localizzazione intracellulare delle proteine spola, né di esercitare effetti citotossici o di influenzare l'attività biologica del suo carico 15.
Qui, presentiamo un protocollo per studiare il significato dei livelli di espressione della proteina nel controllo funzioni cellulari in modo dose guidato. Il protocollo descritto consente una manipolazione perfezionato dell'espressione proteica in vari tipi di cellule di mammifero, inclusi neuroni dell'ippocampo, facilitando così studi dettagliati di funzione proteica a livello cellulare.
Anche se l'interferenza dell'RNA rappresenta una strategia ben noto a down-regolare PO…
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro presentato è stato sostenuto in parte da un finanziamento dal Canadian Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation del programma di partnership Canada a RD, Jerome Lejeune Fondazione di RD, il Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung dell'Università di Erlangen-Norimberga di Rd e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft di RD e RE. Gli autori desiderano ringraziare Ingrid Zenger di assistenza tecnica con la manutenzione coltura delle cellule così come il Prof. M. Wegner per fare un vettore pCMV5-FLAG disponibili. Gli autori inoltre desiderano ringraziare particolarmente Nadja Schroeder per il supporto utile alla ripresa video.
Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20°C |
Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37°C before using |
1xB27 | Life technologies | 17504044 | store at -20°C |
L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20°C |
Penicilline and Streptomycine | Life technologies | 15140-122 | store at -20°C |
Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |