Studerer Protein Funksjon og rolle Altered Protein Expression av antistoff Interferens og Tredimensjonal Rekonstruksjoner

Summary

Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.

Abstract

En streng styring av protein uttrykk er ikke bare viktig i enhver organisme lever, men også en viktig strategi for å undersøke protein-funksjoner i cellemodeller. Derfor nyere forskning oppfunnet forskjellige verktøy for å målrette protein ekspresjon i pattedyrcellelinjer, eller til og med dyremodeller, inkludert RNA og antistoffer interferens. Mens den første strategien har samlet mye oppmerksomhet i løpet av de siste to tiårene, peptider medier en translokasjon av antistoff last over cellemembraner og inn i cellene, fikk mye mindre interesse. I denne publikasjonen gir vi en detaljert protokoll hvordan å utnytte et peptid carrier heter Chariot i humane embryonale nyreceller samt i primær hippocampus nevroner å utføre antistoff interferens eksperimenter og videre illustrere anvendelsen av tredimensjonale rekonstruksjoner i å analysere protein funksjon. Våre funn tyder på at Chariot er, sannsynligvis på grunn av sin kjernefysiske lokalisering signal, particularly godt egnet til å målrette proteiner bosatt i soma og kjernen. Bemerkelsesverdig Ved anvendelse av vognen primære hippocampale kulturer, reagenset viste seg å være overraskende godt akseptert av dissosierte neuroner.

Introduction

En streng kontroll av protein ekspresjon er viktig for alle levende organisme for å kommandere sin egen utvikling, samt for å reagere på miljøsignaler. Derfor har en rekke mekanismer blitt oppfunnet under utvikling til nettopp regulerer uttrykket nivå av hvert protein kodet av programmet. 20.000 gener eksisterer i noen eukaryote celle til enhver tid av sitt liv. Finner sted på ulike stadier av proteinproduksjon, reguleringsmekanismer spenner fra styring av kromatinstruktur, transkripsjon og RNA håndtering til retningen av posttranslational proteinmodifiseringer, transport og degradering.

Det er derfor ikke overraskende at feil i den underliggende molekylære machineries og endrede protein uttrykk nivåer har vært assosiert med ulike sykdommer som kreft eller utviklingshemming. Faktisk, ser på utestående kompleksitet nevrale utvikling og pattedyr hjernens funksjon, den sensitivitet av disse avanserte systemer til endringer i proteinuttrykk manifesterer seg i flere kjente intellektuelle mangler blant annet Alzheimers og Parkinsons sykdom (AD og PD) samt autismespekterforstyrrelser (ASD) som Fragilt X-syndrom (FXS). Den sistnevnte sykdom er kjennetegnet ved en omfattende misexpression av en rekke proteiner, noe som skyldes tap av en enkelt oversettelse regulerende protein, FMRP (Svak X mental retardasjon Protein) ^1-4. Videre kromosomale rearrangements påvirker Variabel kostnad x koblet protein A (VCXA), et protein, som forvalter mRNA stabilitet og oversettelse ved å endre mRNA capping ^5, har nylig vært forbundet med intellektuell underskudd, mens punktmutasjoner ikke ble identifisert hos pasienter med kognitive funksjonshemninger som nå ^{6, 7,} noe som tyder på at de observerte psykiske funksjonsnedsettelser stammer fra endrede VCXA uttrykk og feilregulert uttrykk for sitt mål beskyttins. I tråd med disse funnene, en studie undersøker om de novo kopitall varianter av gener assosiert med ASD etablert at nye genduplikasjon og slettinger er en betydelig risikofaktor for ASD ^8, og dermed støtter ideen om at forhøyet eller redusert protein uttrykk nivåer kan forårsake intellektuell underskudd.

Bemerkelsesverdig, nyere forskning videre gitt bevis for at ekspresjonsnivået av et gitt protein er nøyaktig tilpasset for å hindre at den aggregasjon som en konsekvens av høye proteinmengder med nesten ingen sikkerhetsmarginer ^9. Det har derfor blitt foreslått at selv små økninger er tilstrekkelig til å fremkalle sykdommer som AD og PD ^9. Selv om forskjellige molekyl machineries som bidrar til protein ekspresjonskontrollsekvens foreslår en kompleks regulering som er i lys av disse funnene, en studie undersøkte ekspresjonsnivået av over 5000 pattedyrgener ¹⁰ viste atnaturen foretrukket en mer parsimonious ordning: Den cellulære overflod av proteiner ble vist å være hovedsakelig regulert på nivå med oversettelses ^10, og dermed illustrerer at forvaltningen av RNA tilgjengelighet hovedsakelig tjener til å finjustere protein uttrykk.

Studerer dosen av proteiner av interesse (POI) er derfor ikke bare viktig for forståelsen av de endogene funksjon av et protein, men også for undersøkelse av mange sykdommer og utvikling av behandlingsformer. Dermed har siste tiårene sett forkant av flere strategier som bruker RNA-interferens å manipulere POI dosering. Selv om RNA-interferens blir mye brukt til å studere proteinfunksjon og er også blir brukt i kliniske forsøk for å behandle kreft eller okulære sykdommer, så vel som for å forfølge antiviral terapi i pasienter ^11-13, kan det oppstå visse vanskeligheter som kan gjøre det umulig strategien. For eksempel frøet sekvens, som driver knockdown etter homologi er forholdbare kort, dermed fremme off-target effekter. Siden svært effektive sekvenser er sjeldne og må bli funnet blant tusenvis av alternativer (anmeldt i ^14), identifisere riktig rekkefølge kan være tidkrevende og kostbart, men resultatene kan likevel være skuffende.

En alternativ strategi er å direkte målrette POI etter antistoffer. Her illustrerer vi bruk av proteinbærer Chariot (produsert av Active Motif) for å redusere cellular protein tilgjengelighet, og ansettelse av tredimensjonale rekonstruksjoner for å studere protein funksjon etter knock-down.

Den aktive motivet av vognen i seg selv et 2,8 kDa peptidet, blir brukt til skyt peptider, proteiner og antistoffer på tvers av membraner av pattedyrceller ^15. Peptid forbinder med POI ved å danne ikke-kovalent bundet makromolekylære komplekser utnytte hydrofobe interaksjoner, hvorpå Chariot-POI-komplekser er internalisert inn i celler i en endosomet-independent måte. Viktigere Chariot ble indikert å påvirke hverken den intracellulære lokalisering av skytteltrafikk proteiner, og heller ikke å utøve cytotoksiske effekter eller for å påvirke den biologiske aktivitet av sin last ^15.

Protocol

1. Stock Solutions Resuspender den lyofiliserte aktive motivet pulver i sterilt H2O til en endelig konsentrasjon på 2 ug / ul. Trykk forsiktig for å blande. Forbered små porsjoner (for eksempel 12 pl hver, 2 pl kreves per reaksjon) og lagre dem ved -20 ° C. 2. Fremstilling av Cells Seed pattedyrceller slik som HEK293-celler eller primære neuroner på en 24 brønners plate i 500 pl vekstmedium inkludert antibiotika. MERK: N…

Representative Results

I de følgende avsnittene, eksemplarisk resultatene illustrerer en funksjonell knockdown av et interessepunkt (Simiate, for ytterligere informasjon vennligst se 16, 17) ved hjelp av Chariot reagent og antistoff forstyrrelser blir presentert. Funnene viser at redusert uttrykk for Simiate svekker transkripsjonen aktivitet, og, i en dose avhengig måte, induserer apoptose, som kulminerte i dødelighet på over 99% hvis høyere antistoff mengder (> 1 mg antistoff) brukes (disse funnene bl…

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for å studere betydningen av protein ekspresjonsnivåer i å kontrollere cellulære funksjoner i en dose drevet måte. Protokollen er beskrevet gir en finjustert manipulering av protein uttrykk i ulike pattedyrcelletyper, inkludert hippocampus nevroner, dermed legge til rette for detaljerte studier av protein funksjon på cellenivå.

Selv om RNA interferens er en velkjent strategi for å ned-regulere POI, har det sine ulemper (cp. ^14). Ikke bare id…

Materials

Chariot	Active Motif	30025	store at -20°C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	warm up to 37°C before using
1xB27	Life technologies	17504044	store at -20°C
L-glutamine	Life technologies	25030-149	store at -20°C
Penicilline and Streptomycine	Life technologies	15140-122	store at -20°C
Imaris software	Bitplane	n.a.	expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope	Zeiss	n.a.