Het gebruik van enzymatische biosensoren te kwantificeren endogene ATP of H<sub> 2</sub> O<sub> 2</sub> In de nier
Summary
Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.
Abstract
Enzymatische micro-elektrode biosensoren zijn op grote schaal gebruikt om extracellulaire signalen in real-time te meten. De meeste van hun gebruik is beperkt tot hersencoupes en neuronale celkweken. Recentelijk is deze technologie toegepast op het gehele organen. Vooruitgang in de sensor ontwerp hebben mogelijk gemaakt door het meten van cell signaling in-bloed perfusie in vivo nieren. De huidige protocollen lijst van de stappen die nodig zijn om de ATP en H 2 O 2 signalering in de rat nier interstitium meten. Twee afzonderlijke sensor ontwerpen worden gebruikt voor ex vivo en in vivo protocollen. Beide sensoren zijn bedekt met een dunne enzymatische biolayer bovenop een perm-selectiviteit laag snel reageert gevoelige en selectieve biosensoren geven. De perm-selectiviteit laag beschermt het signaal van de interfererende in biologisch weefsel, en de enzymatische laag maakt gebruik van de opeenvolgende katalytische omzetting van glycerol kinase en glycerol-3-fosfaatfosfaat oxidase in de aanwezigheid van ATP H 2 O 2 produceren. De set van sensoren die worden gebruikt voor de ex vivo studies verder gedetecteerd analyt door oxidatie van H 2 O 2 op een platina / iridium (Pt-Ir) draadelektrode. De sensoren voor de in vivo studies worden in plaats daarvan gebaseerd op de reductie van H 2 O 2 op een mediator beklede gouden electrode ontworpen voor bloed geperfuseerde weefsel. De eindconcentratie wijzigingen worden gedetecteerd door real-time amperometrie gevolgd door kalibrering met bekende concentraties analyt. Bovendien kan de specificiteit van de amperometrische signaal bevestigd door de toevoeging van enzymen zoals catalase en apyrase die breken H 2 O 2 en ATP dienovereenkomstig. Deze sensoren ook sterk afhankelijk van nauwkeurige ijking vóór en na elk experiment. De volgende twee protocollen stellen de studie van real-time detectie van ATP en H 2O 2 in nierweefsels en kunnen verder worden gemodificeerd om de beschreven werkwijze te breiden voor gebruik in andere biologische preparaten of hele organen.
Introduction
Enzymatische micro-elektrode biosensoren (ook genoemd sensoren in dit manuscript) een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van dynamische processen signalering in levende cellen en weefsels is. De sensoren zorgen voor meer temporele en ruimtelijke resolutie van cell signaling moleculen in biologisch relevante concentraties. In plaats van bemonstering en analyse extracellulaire vloeistoffen genomen met tussenpozen gedurende lange tijdsperioden, deze sensoren antwoorden zo snel als de enzymen reageren op de analyt, onder vorming van real-time metingen 1,2. Snelle detectie van interstitiële concentraties van autocriene en paracriene factoren, zoals purinen of waterstofperoxide en de dynamiek van de vrijgave kan worden gebruikt om een profiel vast te stellen voor de effecten van drugs in normale en pathologische condities 3. Momenteel is de meerderheid van de applicaties met behulp van sensoren in hersenweefsel plakjes en celculturen 4-10 geweest. De protocollen beschreven in dit manuscript doelroepen om real-time concentraties analyten geheel nieren nauwkeurig te meten.
De volgende protocollen werden ontwikkeld om interstitiële ATP en H 2 O 2 signalering in nieren bestuderen. In de natuurlijke omgeving van de nier, wordt extracellulair ATP snel gekataboliseerd door endogene ectonucleotidases in zijn derivaten (ADP, AMP en adenosine). De hier gebruikte sensoren zijn zeer selectieve ATP boven andere purines of ATP afbraakproducten 11. Dit biedt een groot voordeel omdat het maakt nauwkeurige controle van de constante en dynamische concentraties ATP vrijgave en de signaleringsfunctie. Interstitiële ATP concentratie wordt gemeten met de combinatie van twee micro-elektroden, een ATP sensor en een sensor Null. De Null sensor in combinatie met catalase toepassingen kan interstitiële detecteren H 2 O 2 concentraties 12. De volgende protocollen gebruik maken van twee verschillende ontwerpen van Sensors die optimale eigenschappen voor zowel ex vivo en in vivo toepassingen.
Beide ontwerpen zijn gebaseerd op de achtereenvolgende katalytische omzetting van glycerol kinase en glycerol-3-fosfaat oxidase in een sensor enzymatische laag en wordt aangedreven door de aanwezigheid van ATP. In de set van sensoren die worden gebruikt in de ex vivo studies, H 2 O 2, het uiteindelijke enzymatische reactie product, wordt gedetecteerd door oxidatie over een platina / iridium (Pt-Ir) draadelektrode. Sensoren voor in vivo studies in plaats daarvan gebaseerd op H 2 O 2 korting op een mediator beklede gouden electrode ontworpen voor bloed geperfuseerde weefsel. Weergegeven in figuur 1 is een schema van beide protocollen in dit manuscript beschreven. De Null sensor identiek is met het overeenkomstige ATP sensor behalve het mist de gebonden enzymen. Daarom, in aanvulling op de detectie van H 2 O 2 met catalase enzym, de Null sensor meagelen niet-specifieke storingen. ATP concentraties worden berekend door de niet-specifieke Null gedetecteerde storingen en achtergrond H 2 O 2 van het ATP sensorsignaal. Meerdere sensoren zijn ook commercieel beschikbaar voor andere analyten zoals adenosine, ionosine, hypoxanthine, acetylcholine, choline, glutamaat, glucose, lactaat, d-serine voor ex vivo toepassingen of adenosine, ionosine en hypoxanthine voor in vivo detecteren wanneer deze is gekoppeld met de bijbehorende Null sensor.
Het vermogen van de sensor om nauwkeurig te detecteren analyten afhankelijk van de juiste pre- en post kalibraties 13. Dit zorgt ervoor dat de analyse verklaart de drift in sensorgevoeligheid die tijdens gebruik in biologische weefsels. De sensor heeft een depot van glycerol die wordt gebruikt als een reagens in de sensor enzymatische reacties. Als de sensor niet wordt gebruikt in bad oplossingen die glycerol, zal het uitspoelen tijd. Kortere rOpnam tijden zijn dan nodig om de sensor drift minimaliseren. Bovendien sensor aangroei van endogene proteasen en eiwitfragmenten kan sterk verminderen de gevoeligheid van de sensoren 14.
De onderhavige manuscript stelt het gebruik van micro-electrode enzymatische biosensoren voor ex vivo en in vivo nieren preparaten. Real-time te analyseren kwantificering biedt ongekend detail van cellulaire signalering die nieuwe inzichten in de mechanismen van nierziekten en farmacologische middelen kunnen onthullen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige protocollen werden ontwikkeld om verbeterde temporele en ruimtelijke resolutie van ATP te bieden en H 2 O 2 signalering voor ex vivo geïsoleerde, geperfuseerd en in vivo bloed geperfundeerde nieren. De verschillen tussen de protocollen en de hier gebruikte sensoren zorgen voor een optimale data-acquisitie voor zowel farmacologische middelen of fysiologische studies. De protocollen bestaan uit 1) sensorkalibratie, 2) chirurgische ingreep, 3) data-acquisitie setup,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij waarderen Sarissa Biomedical voor hun werk in de ontwikkeling van de bij de huidige manuscript sensoren. Dit onderzoek werd gesteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL108880 (A. Staruschenko), HL 116.264 (A. Cowley) en HL 122.662 (A. Staruschenko en A. Cowley), een project gefinancierd door de Medical College of Commissie Wisconsin Onderzoeks zaken # 9306830 (O. Palygin) en Het bevorderen van een gezondere Wisconsin Research and Education Program # 9.520.217, en de Young Investigator Grant van de National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 C before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 C before use |
| Sarissaprobe null sensor 125μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 C before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 C before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 gauge | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications – Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
