Hakket Tissue i Compressed Kollagen: A Cell holdig Biotransplant for Single-iscenesatt rekonstruktiv Repair

Summary

Tissue engineering inkluderer ofte in vitro ekspansjon for å skape autografts for vev gjenfødelse. I denne studien ble en metode for vev ekspansjon, regenerering, og rekonstruksjon in vivo ble utviklet for å minimere behandling av celler og biologisk materiale utenfor kroppen.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

De fleste vev ingeniørstudier på transplantasjon til huden og urogenitaltractus inkluderer autologe celle avlinger fra friskt vev og celle ekspansjon i spesialutstyrte celle-dyrking fasiliteter ^1,2.

Etter celle ekspansjon, blir cellene vanligvis lagres for senere bruk når pasienten er forberedt på å motta autograft. Nitrogen frysere tillate langtidslagring ved lave temperaturer på -150 ° C eller lavere. Fremgangsmåte for frysing må være forsiktig og kontrollert for ikke å miste cellene. En risiko for celledød er krystallisering av intracellulært vann i løpet av tineprosessen, noe som kan føre til ødeleggelse av cellemembraner. Celle frysing utføres vanligvis ved langsom og kontrollert avkjøling (1 ° C per minutt), ved anvendelse av en høy konsentrasjon av celler, føtalt bovint serum, og dimetylsulfoksyd. Etter tining ble cellene må bearbeides på nytt ved å fjerne frysemediet og dyrking av cellekultur plast eller enbiomateriale før transplantasjon tilbake til pasienten.

Alle de ovennevnte fremgangsmåten er tidkrevende, arbeidskrevende og kostbar ^tre. I tillegg er alle in vitro behandling av celler som er ment for pasienten transplantasjon er svært regulert og krever godt trente og akkrediterte personell og laboratorier ^4. Alt i alt, å skaffe en trygg og pålitelig produksjonsprosessen, teknikken kan bare være etablert i et svært lite antall teknisk avanserte sentre og en bredere bruk i vanlige kirurgiske lidelser er tvilsomt.

For å overvinne begrensningene ved celledyrking i laboratorieomgivelser, er begrepet transplantere vev hakket for celle ekspansjon in vivo innføres ved hjelp av kroppen selv som en bioreaktor. For disse formålene, ville autografts fortrinnsvis bli transplantert på en 3D-form i henhold til den form som er nødvendig for den endelige gjenoppbyggingen av organet interest ^5-7.

Opprinnelig var ideen om å transplantere hakket epitel presentert av Meek i 1958 da han beskrev hvordan epitel vokser fra kantene av et sår. Han viste at en liten del av huden vil øke dets marginer og derved dets potensial for celle utvidelse med 100% ved å skjære stykket to ganger i perpendikulære retninger (figur 1) ^8. Teorien har vært støttet av bruk av stormasket delvis tykkelse hud grafts for hudtransplantasjon ⁹ og i huden sårtilheling modeller ^10.

Fig. 1: Meek teori Ifølge Meek teori, vokser epitelet fra kantene av et sår. Ved å øke området avslørt av hakking teknologi, epithelializes hakket vev sår fra mange steder.

Denne studien er basert på hypoOppgaven at samme prinsipp kan anvendes på det subkutane vev ved å plassere hakket epitel rundt en form. Epitelcellene ville mobiliserer fra hakket transplantasjoner (reorganisere), dekke såret områder (migrerer) og dividere (ekspandere) i for å danne en sammenhengende neoepithelium at dekker sårområdet og skiller fremmedlegeme (mold) fra den indre legemet ( Figur 2).

Fig. 2: Cartoon over en 3D mould med kvernet epitelet i in vivo intracorporal ekspansjon vevet ifølge teorien om Meek ved hjelp av hakket vev legges på en form og deretter transplantert til det subkutane vev, er hypotesen at epitelceller migrere fra kantene til kvernet vevet, omdanne, og ekspandere for derved å danne en kontinuerlig neoepithelium det dekker sårområdet og skiller fremmedlegeme (mold) fra den indre legemet.

Selv om tidligere in vivo studier viser lovende resultater, kan ytterligere forbedringer oppnås ved å forsterke de autografts slik at det regenererte epitel kunne motstå mekanisk traume bedre ^7. For disse formålene, ble viktige forutsetninger for en vellykket biomateriale identifisert, for eksempel: enkel diffusjon av næringsstoffer og avfallsprodukter, mulighet til å forme i en 3D måte og easiness av kirurgisk behandling. Konklusjoner ble gjort at disse behov kan oppfylles ved å tilsette en kompositt biomateriale til hakket vev.

Studien sikte på å utvikle et stillas som består av kvernet vev i plast-komprimert kollagen som inneholder en forsterkende kjerne av et biologisk nedbrytbart stoff. Ved hjelp av disse midler, kan levedyktige celler migrere fra hakket vevspartikler og proliferere med morfologiske egenskaper karakteristisk for den opprinnelige epitel (hud eller urothelium). Ved hjelp av plastiske kompresjon, stillaset var redusered i størrelse fra 1 cm til omtrent 420 um som hakket partiklene ble innesluttet i det øvre lag kollagen. Kjernen stoff kan være noen polymer, men må endres med en hydrofil overflate for å interlink med dekker kollagen lag ^11.

Fremgangsmåten ga en forbedret stillaset integritet ved inkorporering av en strikket maske som består av poly (ε-kaprolakton) (PCL) i løpet av to plast komprimert kollagen geler ved å bruke det som et stillas for dyrking av kvernet blære slimhinner eller kvernet hud fra svin. Konstruksjonen ble opprettholdt i celledyrkningsforholdene i opptil seks uker in vitro, demonstrere vellykkede dannelsen av en lagdelt, flerlags urothelium eller plateepitel hud epitel på toppen av en godt konsolidert hybrid konstruksjon. Konstruksjonen var lett å håndtere og kan sys på plass i blæren forsterkningsformål eller tildekking av hud defekter. Alle deler av vev stillaset er FDA-godkjent og teknikkenkunne brukes til ett-trinns prosedyrer ved vev høsting, hakking, plast komprimering, og transplantere tilbake til pasienten som en enkelt-iscenesatt intervensjon. Fremgangsmåten kan utføres for vev ekspansjon og rekonstruksjon under sterile betingelser i en hvilken som helst generell kirurgi enhet.

Protocol

Alle dyr protokoller ble forhåndsgodkjent av Stockholms fylkesnemnda på dyr og alle prosedyrer dannet regelverket for bruk av dyr, samt relevante føderale lover. 1. Animal Prosedyrer Klargjøre Animal for kirurgi Klargjør den kirurgiske bordet med alle materialer og virkemidler som er nødvendig for drift under sterile forhold. Utføre operasjonen utelukkende under sterile betingelser for å redusere risikoen for infeksjon og optimalisere betingelsene i overlevelse ki…

Representative Results

Denne studien viser en metode som viser hvordan man skal fremstille et biomateriale for transplantasjon ved hjelp av plastiske kompresjon av kollagen og hakket vev. Blære slimhinner og hud kan høstes og deretter mekanisk hakket opp i små partikler (figur 3). Av plast kompresjon, blir hakket partiklene innlemmet i kompositt stillaset består av en sentralt plassert bionedbrytbar polymer som er mekanisk sterk innenfor ytre lag av en kollagen-gel (figur 4). …

Discussion

Denne studien viser en lett-å-bruke metode for å fremstille blærevegg plasteret med autologt vev for transplantasjon på operasjonsbordet. Flekkene blir dannet av en kombinasjon av en bionedbrytbar polymer strikking på midten og kollagen med og uten hakket vev i de ytre overflater i kombinasjon med plastiske kompresjon. Plastiske kompresjon er en metode beskrevet tidligere av andre forfattere, og kan defineres som en rask utstøting av væske fra kollagen geler ^12,13. Hakket vev av blæren slimhinne eller…

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3