आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण चूहे में तनाव प्रतिरोध जीनों उजागर करने के लिए - ES कोशिकाओं में एक उच्च throughput स्क्रीन
Summary
तनाव प्रतिरोध दीर्घायु के लिए पहचान की है और आनुवंशिक रूप से नियंत्रित किया जाता है। यहाँ, हम दीर्घायु के अध्ययन के लिए माउस मॉडल विकसित करने के साथ जो ES कोशिकाओं में तनाव प्रतिरोध प्रदान कि म्यूटेशन के लिए स्क्रीन के लिए एक निष्पक्ष उच्च throughput विधि विकसित की है।
Abstract
Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.
Introduction
दीर्घायु तनाव प्रतिरोध के साथ एक अंतरंग संबंध नहीं है। सामान्य में, लंबे समय रहते प्रजातियों अक्सर ऐसे हाइड्रोजन पेरोक्साइड, paraquat (पीक्यू), यूवी, गर्मी, और भारी धातुओं 1,2 के रूप में कई तनाव, की ओर बढ़ा प्रतिरोध प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, तनाव के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता छोटा जीवन काल और / या एक अधिक रोग की आशंका फेनोटाइप की भविष्यवाणी करने के लिए जाता है। एंटी ऑक्सीडेंट सफाई मार्ग लंबे समय जानवर को तनाव प्रतिरोध प्रदान करने में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए अनुमान लगाया गया है। हालांकि, कुछ अपवादों के साथ, विभिन्न एंटी ऑक्सीडेंट एंजाइमों (जैसे, वतन) में जोड़तोड़ के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों की एक किस्म से पढ़ाई ऑक्सीडेंट सफाई एंजाइमों का स्तर बढ़ाने जीवन काल या स्वास्थ्य अवधि 3 वृद्धि नहीं करता है कि संकेत मिलता है। ये आंकड़े लगातार लंबे समय रहते पशुओं में मनाया तनाव प्रतिरोध विशेषता अभी तक पर्दाफाश किया जा करने के लिए अन्य सेलुलर रास्ते द्वारा मध्यस्थता है कि सुझाव।
हम एक निष्पक्ष आगे ले लीआनुवंशिक दृष्टिकोण उत्परिवर्तित पर, सुसंस्कृत भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) में एक तनाव प्रतिरोध फेनोटाइप प्रदान कर सकता है जो जीन की पहचान करने के लिए। ES कोशिकाओं इस अध्ययन में दो प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं: (1) परिष्कृत आनुवंशिक जोड़तोड़ ES कोशिकाओं के जीनोम को संशोधित करने के लिए उपलब्ध हैं; और (2) स्क्रीन से बरामद किसी भी तनाव प्रतिरोधी ते कोशिकाओं को सीधे जीवन काल और स्वास्थ्य अवधि को मापने के लिए पूरे जानवरों के अध्ययन में तेजी से अनुवाद की इजाजत दी, माउस उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस रिपोर्ट में, हम Blm एलिलों एक टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी तत्व द्वारा नियंत्रण में थे जिसमें C9 ते सेल लाइन का उपयोग करते हैं, का वर्णन किया। डॉक्सीसाइक्लिन (dox) के उपचार क्षणिक बहन chromatid विनिमय की वृद्धि की घटना के लिए अग्रणी Blm की अभिव्यक्ति बंद कर दिया। यह अल्पकालिक Blm नाक आउट विषम आबादी के भीतर समयुग्मक म्यूटेशन की पीढ़ी के लिए अनुमति दी तनाव प्रतिरोध के लिए पीछे हटने का म्यूटेशन स्क्रीनिंग प्रक्रिया में कब्जा किया जा सकता है ताकि। हमयह भी बेतरतीब ढंग से जीनोम में जीन रूप बदलना एक पाली-एक जाल कैसेट (पीबी-संप्रग) डालने के लिए उत्परिवर्तजन के रूप में piggyBac (पंजाब) transposon के उपयोग का वर्णन किया। पाली-एक जाल द्वारा एक जीन के विघटन के साथ कोशिकाओं G418 प्रतिरोधी बन गया है और जीन-जाल म्यूटेंट (जीन-जाल पुस्तकालय) का एक संग्रह बनाया, और बाद में प्रतिरोधी तनाव थे कि उत्परिवर्ती क्लोन के लिए जांच की जा सकती है, ताकि ठीक किया जा सकता है।
चयन से बरामद तनाव प्रतिरोधी क्लोन सम्मिलन की संख्या (qPCR) के संबंध में आणविक तकनीक के द्वारा नहीं बल्कि तेजी से होती जा सकता है, सम्मिलन की साइट (splinkerette पीसीआर), बाधित जीन (ब्लास्ट) की पहचान की है, और इसकी अभिव्यक्ति के स्तर ( RT-qPCR)। पंजाब प्रविष्टि प्रकार के जंगली डीएनए अनुक्रम को बहाल करने और इस प्रकार तनाव प्रतिरोध के नुकसान के लिए परीक्षण करने के लिए क्लोन में MPB Transposase के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा remobilized किया जा सकता है। ये पहले किया जाना चाहिए, जो उत्परिवर्तन की करणीय पुष्टि करने के लिए शक्तिशाली तरीके हैं,महंगा माउस उत्पादन करने के लिए। पिछले अध्ययनों से तनाव के संपर्क में कोशिकाओं को उनके pluripotency 4,5 खो दिया है कि पता चला है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में, तनाव के साथ नहीं माना जाएगा जो उत्परिवर्ती कोशिकाओं का सेट एक प्रतिकृति, के संरक्षण के सफल माउस उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है।
हमारी प्रयोगशाला दोनों अनुरोध पर अन्य जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं, C9 ते सेल लाइन और पीबी संप्रग वेक्टर इंजीनियर है। यहां बताया प्रोटोकॉल तनाव प्रतिरोधी क्लोन (चित्रा 1 बी) को अलग करने की प्रतिकृति चढ़ाना और तनाव चयन के बाद पीबी संप्रग (चित्रा 1 ए) के साथ जीन-फंस ते कोशिकाओं की नए सिरे से पुस्तकालय की पीढ़ी से शुरू होगा। हम paraquat, कोशिकाओं के अंदर एक शक्तिशाली मुफ्त कट्टरपंथी जनरेटर के साथ चयन का प्रदर्शन किया। वस्तुतः, उदाहरण के लिए किसी भी साइटोटोक्सिक यौगिक या विष, ईआर तनाव (जैसे, thapsigargin और tunicamycin), न्यूरोनल ऑक्सीडेंट (जैसे, एमपीपी + 6 हाइड्रोक्सी डोपामाइन, और rotenone), गर्मी, और भारीधातुओं (जैसे, सीडी, एसई), संबंधित प्रतिरोधी म्यूटेंट के लिए चयन करने के लिए विधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetic analysis allows for an unbiased interrogation of the genome for genes responsible for a specific phenotype. This method is very powerful to uncover novel gene functions. It has been widely used in lower organisms but not in mammal, such as the mouse, mainly due to the extremely high cost associated with the infrastructure and logistics that would entail. Here, we moved the genetic screening process to the ES cell culture platform, greatly increasing the efficiency and throughput in generating mutants a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Wellcome Trust Sanger Institute for the gifts of piggyBac transposon and piggyBac transposase. This work was supported by the Butcher grant of Colorado and the NIH R01 AG041801 (W.S.C).
Materials
| Vector | ||
| PB-UPA | ||
| mPBase | ||
| mPBasePuro | ||
| Tissue Culture | ||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 |
| T25 Flask | Corning | 353108 |
| T75 flask | Corning | 353135 |
| 100-mm plate | Corning | 353003 |
| 150-mm plate | Corning | 430599 |
| 96-well plate | Corning | 3585 |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 |
| 24-well plate | Corning | 3526 |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | |
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 |
| Electroporation | ||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 |
| Molecular Biology | ||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 |
| Electrophoresis | ||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S |
| 1Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L |
References
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