Protocole pour l'isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Summary

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Abstract

A côté hépatocytes parenchymateux, le foie est constitué de cellules non parenchymateuses (NPC), à savoir les cellules de Kupffer (KC), le foie des cellules endothéliales (LEC) et des cellules étoilées hépatiques (HSC). Deux dimensions (2D) culture de primaire hépatocytes humains (PHH) est toujours considéré comme le «gold standard» pour les tests in vitro du métabolisme des médicaments et l' hépatotoxicité. Il est bien connu que la monoculture 2D de PHH souffre de dédifférenciation et la perte de fonction. Récemment, il a été montré que hépatique NPC jouent un rôle central dans le foie (patho) physiologie et le maintien des fonctions PHH. La recherche actuelle se concentre sur la reconstruction de l' architecture in vivo dans des tissus en 3D- et co-culture des modèles pour surmonter les limites des monocultures 2D. Auparavant , nous avons publié une méthode pour isoler les cellules du foie humain et étudié l'aptitude de ces cellules pour leur utilisation dans des cultures cellulaires en biologie expérimentale et de médecine ^1. Sur la base de l'intérêt général dans ce technique le but de cet article était de fournir un protocole plus détaillé pour le processus d'isolement des cellules du foie, y compris une vidéo, ce qui permettra une reproduction facile de cette technique.

des cellules hépatiques humaines ont été isolées à partir d'échantillons de tissu hépatique humain des interventions chirurgicales par une EGTA / P collagénase technique de perfusion en deux étapes. PHH ont été séparés de l'APN par une centrifugation initiale à 50 x g. Densité étapes de centrifugation à gradient ont été utilisés pour l'élimination des cellules mortes. populations de cellules hépatiques individuels ont été isolés à partir de la fraction enrichie NPC en utilisant les propriétés de cellules spécifiques et des procédures de tri des cellules. A côté de l'isolement PHH nous avons pu séparer KC, LEC et HSC pour plus de culture.

Pris ensemble, le protocole présenté permet l'isolement de PHH et NPC en haute qualité et la quantité d'échantillon de tissu d'un donneur. L'accès aux populations de cellules du foie purifiées pourrait permettre la création d'in vivo comme li humainemodèles de ver.

Introduction

un tissu de foie humain est très complexe et se compose de deux entités différentes de cellules, les cellules parenchymateuses et les cellules non parenchymateuses (CNP). les cellules hépatiques parenchymateuses comprennent hépatocytes et cholangiocytes. Hepatocytes représentent 60 à 70% des cellules hépatiques totales et représentent la majeure partie des fonctions métaboliques du foie, par exemple l' acide biliaire et de compléter la synthèse du facteur, la biotransformation et le métabolisme énergétique de ^2,3.

La fraction NPC inférieure constitue 30 à 40% des cellules hépatiques totales. NPC comprennent les populations de cellules différentes, à savoir les cellules de Kupffer (KC), les cellules hépatiques endothéliales (LEC) et les cellules hépatiques étoilées (HSC). Cette fraction cellulaire hétérogène joue un rôle central dans les processus physiologiques du foie. En outre, NPC participer à la médiation des lésions hépatiques aiguës, par exemple, une lésion induite par le médicament foie (DILI), ainsi que des blessures chroniques du foie, comme la cirrhose ^4.

Au cours des dernières années, hles cellules du foie Uman sont devenus de plus en plus essentiel dans la recherche et le développement du dépistage des drogues, le développement de médicaments et l'identification de nouvelles voies biochimiques dans les maladies du foie. Pour les tests in vitro monocultures PHH sont encore considérés comme le «gold standard» ^5. La principale limite des modèles actuels de foie homotypique est dédifférenciation et la perte de fonction des hépatocytes en quelques jours ^4. La mise en place de 3 dimensions techniques (3D) de culture a montré que ces limitations peuvent être compensées ^4,6. Cependant, même les techniques de culture 3D modernes ne sont pas en mesure d'afficher tous les modes hépatotoxiques des actions ^7. Disparues populations NPC dans les modèles in vitro existants sont discutés comme une raison possible de cet écart à la situation in vivo. Il a été démontré que la communication cellulaire entre les différentes populations de cellules du foie joue un rôle central dans l'homéostasie physiologique, mais aussi dans pathophysiologic traite ^8. Par conséquent, l'attention scientifique se concentre de plus en plus sur les PNJ et leurs interactions cellule-cellule. Leur utilisation délibérée en co-culture et les systèmes de l' ingénierie tissulaire pourrait être une solution pour la forte demande des modèles in vitro du foie ^8,9 qui sont aussi proches de la situation in vivo que possible.

Actuellement, le principal défi est le développement d'un modèle de co-culture de foie humain standardisé, qui contient des parties clairement définies de PHH et NPC. En conséquence, les techniques d'isolement des cellules hépatiques très hétérogènes sont nécessaires et celles-ci doivent être optimisés pour obtenir des populations cellulaires pures. Bien que des protocoles normalisés pour PHH isolement existent ^10, l'isolement normalisé de NPC humaine est encore en développement. Protocoles d'isolement NPC plupart des publications sont basées sur des expériences avec des cellules non humaines ^11,12. Seules quelques publications décrivent le processus d'isolement des PNJ humain et plus ne couvrent quedes procédés pour l'isolement d'une cellule de type ^16/11. Les caractéristiques les plus importantes de cellules qui ont été mises à profit pour la séparation des cellules sont la taille, la densité, le comportement de fixation, et l'expression des protéines de surface. Sur la base de ces caractéristiques , nous avons développé un protocole simplifié pour isoler PHH, KC, LEC et HSC, qui a été publié précédemment dans la biologie expérimentale et de médecine ^1. Étant donné le grand intérêt de cette technique, le but de cet article est de fournir un protocole plus détaillé du procédé d'isolement des cellules du foie, y compris la vidéo, ce qui permettra de reproduire la technique plus aisément. Le protocole comprend également des méthodes de contrôle de qualité pour l'évaluation du rendement et de la viabilité, ainsi que pour l'évaluation de l'identification et de la pureté en utilisant immunomarquages ​​spécifiques.

Protocol

Remarque: Toutes les cellules ont été isolées à partir de tissu de foie réséqué non tumorales humaines, qui est restée après résection partielle du foie des tumeurs hépatiques primaires ou secondaires. Le consentement éclairé des patients a été obtenu selon les directives éthiques de la Charité – Universitätsmedizin Berlin. 1. Préparation des matériaux et solutions Stériliser tous les instruments et les matériaux à l'avance pour éviter la contamination …

Representative Results

La séparation en une fraction du parenchyme et non parenchymateuse, en utilisant la centrifugation en gradient de densité comme une procédure de nettoyage combinée à l'utilisation des propriétés d'adhérence et MACS conduit à succès PHH et NPC isolement. PHH et NPC peuvent être isolés en haute qualité et la quantité. La figure 1 montre la configuration représentative de l'équipement pour la perfusion du foie et la digestion. 10% de FCS a été …

Discussion

Le protocole publié décrit une technique pour isoler pur PHH et NPC, à savoir KC, HSC et LEC, simultanément en haute qualité et la pureté du même échantillon de tissu de foie humain. La majorité des publications traitant des isolements de cellules hépatiques ne couvrent que l' un de ces populations de cellules ^18-20 et les procédures d'isolement réalisées avec des tissus humains sont rares (examinés par Damm et al.) ^21. Adaptation des méthodes établies avec les tiss…

Materials

General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 – 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 – 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G