Protocollo per l'isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali
Summary
A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.
Abstract
Accanto epatociti parenchimali, il fegato è costituito da cellule non parenchimali (NPC) vale a dire cellule di Kupffer (KC), fegato le cellule endoteliali (LEC) e le cellule stellate epatiche (HSC). Bidimensionale (2D) cultura di primaria epatociti umani (PHH) è ancora considerato come il "gold standard" per i test in vitro del metabolismo dei farmaci e di epatotossicità. È ben noto che la monocultura 2D PHH soffre dedifferentiation e perdita di funzione. Recentemente è stato dimostrato che epatica NPC giocano un ruolo centrale nel fegato (patologica) fisiologia e il mantenimento delle funzioni PHH. La ricerca attuale si concentra sulla ricostruzione di vivo dell'architettura tessuto da 3D-e co-coltura modelli di superare i limiti di monocolture 2D. In precedenza abbiamo pubblicato un metodo per isolare le cellule di fegato umano e studiato l'idoneità di queste cellule per il loro impiego in colture cellulari in Biologia e Medicina Sperimentale 1. Sulla base del vasto interesse in questo technique lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo più dettagliata del processo di isolamento delle cellule epatiche tra cui un video, che permetterà un facile riproduzione di questa tecnica.
cellule epatiche umane sono state isolate da campioni di tessuto di fegato umano di interventi chirurgici da un EGTA / collagenasi tecnica P perfusione in due fasi. PHH stati separati dal NPC da una centrifugazione iniziale a 50 x g. Densità fasi di centrifugazione a gradiente sono stati usati per la rimozione delle cellule morte. popolazioni di cellule individuali del fegato sono stati isolati dalla frazione arricchita NPC utilizzando le proprietà cellulari specifici e le procedure di separazione delle cellule. Accanto l'isolamento PHH siamo stati in grado di separare KC, LEC e HSC per ulteriori coltivazione.
Nel loro insieme, il protocollo presentato permette l'isolamento di PHH e NPC in alta qualità e la quantità di campione di tessuto da un donatore. L'accesso alle popolazioni di cellule del fegato purificati potrebbe consentire la creazione di in vivo come Li umanamodelli ver.
Introduction
tessuto epatico umano è molto complesso e consiste di due diverse entità cellulari, cellule parenchimali e cellule non parenchimali (NPC). cellule epatiche parenchimali includono epatociti e colangiociti. Gli epatociti rappresentano dal 60 al 70% delle cellule del fegato totali e rappresentano la maggior parte delle funzioni epatiche metaboliche, ad esempio, acidi biliari e completano la sintesi fattore, biotrasformazione ed energia metabolismo 2,3.
La frazione NPC minore costituisce il 30-40% delle cellule epatiche totali. NPC includono diverse popolazioni di cellule, ovvero cellule di Kupffer (KC), le cellule del fegato endoteliali (LEC) e le cellule stellate epatiche (HSC). Questa frazione cellulare eterogenico gioca un ruolo centrale in processi fisiologici del fegato. Inoltre, NPC partecipare a mediare danno epatico acuto, ad esempio, lesioni indotte dal farmaco fegato (DILI), così come nelle lesioni croniche del fegato, come la cirrosi 4.
Negli ultimi anni, hcellule epatiche Uman sono diventati sempre più essenziale nella ricerca e nello sviluppo di test anti-droga, lo sviluppo di farmaci e l'identificazione di nuove vie biochimiche nelle malattie del fegato. Per i test in vitro monocolture PHH sono ancora considerati come il "gold standard" 5. La principale limitazione degli attuali modelli di fegato omotipiche è dedifferentiation e perdita di funzione degli epatociti nel giro di pochi giorni 4. La creazione di tecniche (3D) cultura 3-dimensionale ha dimostrato che questi limiti possono essere compensate 4,6. Tuttavia, anche le moderne tecniche di coltura 3D non sono in grado di visualizzare tutte le modalità epatotossici di azioni 7. Manca popolazioni NPC nei modelli esistenti in vitro sono discussi come possibile motivo di questa discrepanza per la situazione in vivo. È stato dimostrato che la comunicazione cellula-cellula tra le diverse popolazioni cellulari fegato gioca un ruolo centrale nella omeostasi fisiologica, ma anche in pathophysiologic elabora 8. Pertanto l'attenzione scientifica si concentra sempre di più sulla NPC e le loro interazioni cellula-cellula. Il loro utilizzo mirato in co-coltura e sistemi di ingegneria tessutale potrebbe essere una soluzione per la forte domanda di modelli di fegato in vitro 8,9 che sono il più vicino alla situazione in vivo possibile.
Attualmente la sfida principale è lo sviluppo di un modello di fegato di co-cultura umana standardizzata, che contiene porzioni ben definite di PHH e NPC. Di conseguenza, tecniche di isolamento per le cellule del fegato molto eterogenei sono necessari e quelli devono essere ottimizzate per ottenere popolazioni di cellule pure. Mentre esistono protocolli standardizzati per l'isolamento PHH 10, l'isolamento standardizzato di NPC umano è ancora in fase di sviluppo. Protocolli di isolamento NPC più pubblicati sono basati su esperimenti con le cellule non umane 11,12. Solo pochi pubblicazioni descrivono il processo di isolamento della NPC umana e la maggior parte coprono soloMetodi per l'isolamento di una singola cellula tipo 11-16. Le caratteristiche cellulari più importanti che sono stati sfruttati per la separazione cellulare sono dimensione, densità, comportamento di attaccamento, e l'espressione di proteine di superficie. Sulla base di queste caratteristiche abbiamo sviluppato un protocollo semplificato per isolare PHH, KC, LEC e HSC, che è stato pubblicato in precedenza in Biologia e Medicina Sperimentale 1. A causa del grande interesse in questa tecnica, lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo più dettagliata del processo di isolamento delle cellule epatiche tra cui un video, che consentirà riproducendo la tecnica più facilmente. Il protocollo include anche i metodi di controllo di qualità per la valutazione della resa e la vitalità, nonché per l'identificazione e la purezza valutazione con immunostainings specifici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo pubblicato descrive una tecnica per isolare puro PHH e NPC, cioè KC, HSC e LEC, simultaneamente in alta qualità e purezza dallo stesso campione di tessuto epatico umano. La maggior parte delle pubblicazioni che si occupano di isolamenti cellule del fegato coprono solo una di quelle popolazioni cellulari 18-20 e le procedure di isolamento eseguiti con i tessuti umani sono rari (recensito da Damm et al.) 21. Adattamento dei metodi stabiliti con tessuto animale (ad esempio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Jia Li Liu per il loro supporto nella creazione della figura 1. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'Istruzione e Progetto di ricerca (BMBF) Fegato virtuale: 0.315.741.
Materials
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| pipettes | Eppendorf | ||
| microscope | Carl Zeiss | ||
| microscope | Olympus | ||
| CO2-incubator | Binder | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| Centrifuge Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| Urine Beaker | Sarstedt | 2041101 | |
| perfusor syringe 50 ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| Bottle Top Filter | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352096 | |
| Tissue Culture plate | BD Biosciences | 533047 | 24 well |
| serological pipettes | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| pipette tips | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µl, 200 µl, 1000 µl |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Equipment | |||
| water bath | Lauda | ||
| peristaltic pump | Carl Roth | ||
| circulation thermostat | Lauda | ||
| pH meter | Schott | ||
| fine scales | Sartorius | ||
| stand | |||
| Büchner funnel | Haldenwanger | ||
| plastic funnel | |||
| silicone tube | |||
| cannulae with olive tips | |||
| glass dish | |||
| forceps | |||
| scalpel | Feather | 12068760 | |
| Neubauer counting chamber | Optic Labor | ||
| cell lifter | Costar | ||
| Surgical Drape | Charité Universitätsmedizin Berlin | A2013027 | |
| compress | Fuhrmann | 40013331 | |
| sterile surgical gloves | Gammex PF | 1203441104 | |
| Tissue glue | B. Braun | 1050052 | |
| glass bottle | VWR | ||
| Collagenase P | Roche | 13349524 | |
| Percoll Separating Solution | Biochrom | L6145 | Density 1.124 g/ml |
| Hank’s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15 – 002 | without Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1,064,041,000 | |
| KCl | Merck | 49,361,000 | |
| Hepes Pufferan | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine) |
| HEPES Buffer Solution 1M | GIBCO | 1135546 | |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 – 039 | without L-Glutamine |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William’s E | GIBCO | 32551-020 | |
| with GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| Human-Insulin | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-Acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for Immunostainings | |||
| CD 68 | R&D Systems, USA | monoclonal | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | polyclonal |
| CK18 | Santa Cruz | K2105 | monoclonal |
| Vimentin | Santa Cruz | monoclonal | |
| GFAP | Sigma Aldrich | monoclonal | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| Goat anti-Mouse IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| Goat anti-rabbit IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| Methanol | J.T.Baker | 1104509006 | |
| Formaldehyde 4% | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
References
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