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Articolo metodologico

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

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DOI:

10.3791/53070

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15 luglio 2015

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1Department of Cancer Imaging and Metabolism, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un test di sensibilità ai farmaci ad alto rendimento per cellule primarie di mieloma multiplo. Consiste in una ricostruzione del microambiente del midollo osseo (compresa la matrice extracellulare e lo stroma) in piastre multipozzetto e in un metodo non invasivo per la quantificazione longitudinale della vitalità cellulare.

Abstract

In questo lavoro descriviamo un nuovo approccio che unisce ex vivo test di sensibilità di droga e l'analisi di immagini digitali per stimare chemiosensibilità ed eterogeneità di mieloma multiplo (MM), le cellule derivate da pazienti. Questo approccio consiste nel seminare cellule di MM primarie appena estratti da aspirati midollari nelle camere di microfluidica attuate in piastre multi-così, ognuno composto da una ricostruzione del microambiente midollare, tra cui matrice extracellulare (collagene o membrana basale matrice) e stroma (paziente- le cellule staminali mesenchimali derivate) o cellule endoteliali umane di derivazione (HUVECs). Le camere sono drogati con diversi agenti e concentrazioni, e vengono esposte in sequenza per 96 ore attraverso il microscopio a campo luminoso, in un microscopio motorizzato dotato di una fotocamera digitale. Software di analisi dell'immagine digitale rileva le cellule vive e morte dalla presenza o assenza di movimento della membrana, e genera le curve di cambiamento della redditività in funzione of concentrazione di farmaco e il tempo di esposizione. Usiamo un modello computazionale per determinare i parametri di chemiosensibilità della popolazione tumorale per ciascun farmaco, così come il numero di sub-popolazioni presenti come misura di eterogeneità tumorale. Questi modelli su misura del paziente possono poi essere utilizzati per simulare regimi terapeutici e valutare la risposta clinica.

Introduzione

L'obiettivo di questo metodo è quello di caratterizzare la sensibilità ai farmaci del mieloma multiplo (MM) cellule primarie ad un pannello di agenti ex vivo, il più vicino possibile alle condizioni fisiologiche, e con sufficiente precisione che questi risultati possono essere utilizzati per identificare chemioresistente sub popolazioni nel carico tumorale e, in ultima analisi, di parametrizzare modelli computazionali studiati per valutare la risposta clinica.

Modelli di calcolo sono strumenti potenti per analizzare sistemi complessi, quali le interazioni tumore-ospite-terapia. Tuttavia, i modelli sono solo buono come i dati utilizzati per parametrizzare loro. Sfortunatamente, la maggior parte dei dati disponibili in letteratura non possono essere utilizzati nella forma attuale di parametrizzare tali modelli, in quanto spesso vengono ottenuti in condizioni sperimentali reciprocamente esclusivi. Così, nuovi esperimenti sono spesso richiesti con l'obiettivo di ottenere il set di parametri sperimentali necessari. La maggior parte dei saggi di vitalità, tuttavia, sono distruttive e thCi limitati a un piccolo numero di punti di tempo, spesso solo uno. Questo ostacola notevolmente l'utilizzo di test di chemiosensibilità a parametrizzare modelli computazionali, dal momento che tali esperimenti non riescono a fornire informazioni sulla dinamica temporale del sistema. Ciò è particolarmente vero con le cellule tumorali primari, che sono spesso limitati a pochi milioni per campione, e hanno una vita breve dopo la biopsia, limitando così il numero di condizioni sperimentali. Inoltre, la maggior parte dei saggi di vitalità richiedono la separazione del cancro dai non-cancro (stroma) cellule al momento della quantificazione, che aggiunge lavoro extra al protocollo, perturba ulteriormente le cellule, e limita il numero di esperimenti che possono essere eseguite .

40 anni fa, salmone e collaboratori 1 hanno proposto il loro famoso in vitro colonie formazione per la valutazione di chemiosensibilità delle cellule tumorali. Purtroppo questo test trovate alterne fortune a causa del piccolo numero di mye multiplaloma (MM) campioni di pazienti che erano in grado di formare colonie in condizioni di controllo: è stato stimato che solo un piccolo sottogruppo di 0.001% al 0,1% di cellule di MM sono stati in grado di riprodursi, di essere definiti come le cellule staminali mieloma multiplo 2. Questo limita significativamente il tasso di successo del saggio e il numero di farmaci che possono essere testati in una sola volta, anche in modelli più recenti 3. La questione è molto più importante ora, quando gli agenti mm (standard o sperimentali) sono più numerose di quattro decenni fa.

Una limitazione importante di questi primi saggi è la loro uscita dicotomizzate: o un paziente è "sensibili" o "resistenti" ad un particolare farmaco. Non vengono fornite informazioni relative al grado di sensibilità ed eterogeneità della popolazione tumorale. Pertanto, i pazienti con piccole sottopopolazioni di cellule resistenti rapida crescita sarebbero classificate come "sensibili" per la terapia, ma sarebbe ricaduta a breve, e quindi non benEFIT dal trattamento. Data l'importanza della durata della risposta in termini di sopravvivenza globale (OS) dei pazienti oncologici 4,5, è chiaro come questi test non sono stati in grado di stimare correttamente OS coerente.

Per aggirare queste limitazioni, e di essere in grado di generare modelli computazionali specifici del paziente che stimare la risposta clinica personalizzato ad un pannello di farmaci, abbiamo sviluppato un metodo per la sensibilità ai farmaci test non distruttivo di mieloma multiplo (MM) linee cellulari e cellule di MM primarie in un ex vivo ricostruzione del midollo microambiente osseo, tra cui matrice extracellulare e stroma 6. Questa analisi, tuttavia, aveva la limitazione di basarsi su un particolare diapositiva microfluidico commerciale, le cui dimensioni e costo limitato il numero di esperimenti o farmaci che potrebbero essere effettuata una volta in un determinato materiale.

Il sistema qui descritto estende questo saggio originale in un alto-throughput organotipica piattaforma dose-risposta, per lo screening in vitro di farmaci, basato su un algoritmo di analisi di immagine digitale non distruttivo quantificare la vitalità cellulare. Ogni bene in 384 e 1.536 pozzetti piastre è una ricostruzione in 3D del midollo microambiente osseo, incluse le cellule primarie di MM, matrice extracellulare, e stroma e fattori di crescita di derivazione del paziente. Microscopia diretta e analisi digitale sono utilizzati per rilevare eventi morte cellulare a concentrazioni del farmaco diversi, che vengono utilizzati per generare superfici dose-risposta. Dai dati in vitro, un modello matematico identifica la dimensione e la chemiosensibilità delle sub-popolazioni all'interno carico tumorale del paziente, e può essere utilizzato per simulare il tumore risponderà al farmaco (s) in condizioni fisiologiche in un regime clinica 6 ( Figura 1).

Le principali innovazioni di questa piattaforma sono: (a) piccolo numero di cellule tumorali richiesti (1.000-10.000 per concent drogarazione); (B) la valutazione di efficacia dei farmaci in condizioni fisiologiche (matrice extracellulare, stroma, i fattori di crescita di derivazione del paziente); (C) Nessuna tossicità da vitalità marcatori 7 dal momento che solo l'imaging in campo chiaro è usato, quindi non c'è bisogno di trasfettare cellule con fluorescenza 8 o bioluminescenza 9; (D) l'imaging continuo fornisce effetto del farmaco in funzione della concentrazione e tempo di esposizione (farmacodinamica); e (e) l'integrazione tra modelli in vitro e computazionali evolutivi, stimare esito clinico 6 (Silva et al., in preparazione).

Il fattore chiave che permette l'algoritmo di analisi di immagine digitale di discernere cancro da cellule stromali è la differente affinità al fondo del pozzo: cellule di MM non aderiscono, e rimangono in sospensione nella matrice, mentre le cellule stromali aderire al fondo del bene e poi allungare.

Questa separazione si verifica anche se MM e stroma unre seminate allo stesso tempo, e si verifica durante il processo / N O di incubazione. La fase di arresto nella centrifuga seguente semina della piastra accelera ulteriormente questo processo. Di conseguenza, le cellule MM appaiono nell'immagine come dischi luminosi rotonda circondata da un anello scuro, mentre lo stroma mantiene un profilo basso e più scura (Figura 2). Così, il test nella sua forma attuale è la più adatta per le cellule tumorali non aderenti, anche se adeguamenti dell'algoritmo potrebbe essere fatto al cancro e stroma separata sulla base di altre caratteristiche morfologiche, come la dimensione e la forma. In questo protocollo descriviamo due tipi di matrice extracellulare (collagene e matrice di membrana basale) e due tipi di co-culture, con (midollo derivate cellule staminali mesenchimali ossee) BMSC e HUVEC, rappresenta le nicchie interstiziali e perivascolari del midollo osseo rispettivamente.

Utilizzando una piastra a 384 pozzetti, 5 concentrazioni per droga e due repliche, siamo stati in grado di TESt fino a 31 diversi farmaci con il campione di un singolo paziente. In piastre 1.536 pozzetti questo numero è 127. Figura 3 illustra lo schema attualmente utilizzata per la semina delle cellule manuale, mentre supplementare figura 1 rappresenta la distribuzione ottimale utilizzando una pipetta robotica. Nel disegno di figura 3, ogni piatto 384 pozzetti può trasportare 3 campioni di pazienti con 7 diversi farmaci, o un campione paziente testato con 21 farmaci. Ogni farmaco è rappresentato da 5 concentrazioni, e ciascuna condizione è seminato in duplicato. 4 pozzetti di controllo (nessun farmaco è mio) vengono seminate per ogni set di 7 farmaci (ad esempio, pozzi 36-39, 126-129 e 200-203). Per garantire l'efficacia dei farmaci utilizzati, una linea cellulare di mieloma umano (ad esempio, H929 o MM1.S) è anche inseminate, drogato in duplicato alla più alta concentrazione di ciascuno dei farmaci utilizzati (pozzi 76-89). Il controllo linea cellulare positiva assicura che i farmaci utilizzati hanno sufficiente potenza, dal momento che le loro curve dose-risposta sono ac comparabiliEsperimenti Ross. Due pozzi sono seminati con una linea cellulare di mieloma come controllo per le condizioni ambientali, in altre parole, per rilevare possibili problemi nel banco superiore incubatore durante l'imaging (pozzi 75 e 90). L'enumerazione dei pozzetti segue un andamento a zig-zag in modo da ridurre la distanza coperta dalla fase motorizzato del microscopio, che riduce il tempo di acquisizione e riduce l'usura dell'apparecchiatura.

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Protocollo

L'uso di cellule umane derivate da biopsie è stato approvato dal Comitato Etico del Moffitt e condotta sotto la sperimentazione clinica MCC # 14745 condotto presso l'H. Lee Moffitt Cancer Center e Istituto di ricerca come descritto di seguito.

1. Selezione di MM cellule da midollo osseo aspirati

  1. Raccogliere aspirati di midollo osseo (20 ml) di pazienti in siringa eparina sodica.
  2. Isolare le cellule mononucleate mediante centrifugazione osseo diluito (1: 1 con PBS sterile) su un gradiente di mezzo sterile acquosa centrifugazione a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente.
  3. Raccogliere l'interfaccia, che contiene le cellule mononucleari. Lavare le cellule con PBS freddo e contare con un emocitometro o contatore di cellule automatizzata, utilizzando trypan blu per la determinazione della redditività.
  4. Preparare un strato sottile preparazione cellulare slide 10 e macchia con macchia Wright-Giemsa per valutare la percentuale delle plasmacellule 11.
  5. Calcolarela quantità di perline CD138 da utilizzare in base al numero di cellule e la percentuale delle cellule di plasma. Se si parte da campione è inferiore a 20% cellule del plasma, quindi risospendere cellule utilizzando 90 ml di tampone di separazione e 10 ml di CD138 perle per 5 x 10 6 cellule. Se l'avvio del campione è superiore al 20% delle cellule plasmatiche, risospeso utilizzando 80 ml ​​di tampone di separazione e 20 ml di CD138 perle per 1 x 10 7 cellule.
  6. Incubare le cellule con perline a 4 ° C per 15 min.
  7. Far passare cellule attraverso un colino 35 micron aggiunti separazione di pre-bagnato (LS) colonne posizionati nel separatore di campo magnetico (vedi elenco dei materiali).
  8. Rimuovere colonna dal magnete. Raccogliere cellule CD138-selezionato lavando la colonna 3 volte con 1 ml di tampone di separazione.
  9. Valutare CD138 arricchimento con un'altra preparazione cellulare sottile strato colorato scorrere 10.
  10. Filtro plasma ottenuto da biopsia del midollo osseo da ciascun paziente con un filtro a siringa da 0,22 micron. Utilizzare plasma frescodallo stesso paziente come le cellule CD138 +.
  11. Preparare il supporto per l'esperimento, completandola RPMI-1640 con il 10% di calore inattivato siero fetale bovino, il 10% del plasma del paziente e l'1% di penicillina-streptomicina.
  12. Raccogliere il flusso continuo della selezione (CD138-) e seguire il metodo di adesione classica 12 per selezionare le cellule mesenchimali del midollo osseo (BMSCs). Poiché questo processo richiede settimane prima BMSCs sono pronti per essere utilizzati, è necessario avere BMSCs pronti da pazienti precedenti o donatori sani.

2. Le cellule semina Piastre (utilizzando un manuale Pipetta multicanale)

  1. Utilizzare una piastra multi-pozzo (384 o 1.536), con pareti nere e un fondo piatto trasparente, preferibilmente uno ottimizzato per applicazioni ottiche e colture cellulari.
  2. Co-coltura con cellule di MM BMSCs in entrambe collagene di tipo I o matrice membrana basale, tuttavia, richiedono HUVECs matrice membrana basale.
  3. Mantenere le densità finali di ogni tipo di cellula inla seguente gamma: 3 x 10 5 cellule / ml per linee cellulari di MM, 2 x 10 5 cellule / ml per HUVECs o BMSCs, e 2 x 10 6 cellule / ml per cellule di MM derivati ​​da pazienti.
    Nota: queste densità sono il risultato di ottimizzazione sperimentale per consentire la massima qualità dell'immagine possibile e più lungo tempo di imaging possibile mantenendo rilevanza biologica nei saggi. Linee cellulari di MM vengono seminate a densità più basse rispetto alle cellule di MM primarie a causa della loro velocità di replicazione più veloce e più grande formato.
  4. Co-coltura di cellule di MM primarie con BMSCs:
    1. Preparare aliquote di 100 microlitri di media premiscelato composto da 20 ml di 10x MEM, 20 l di H 2 O deionizzata, 10 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio e 50 ml di 1x RPMI 1.640 e conservare a 4 ° C.
    2. Al momento della semina delle piastre con cellule di MM, mescolare aliquote di supporto pre-miscelato con 150 ml di 3,1 mg / ml bovino collagene di tipo I in un volume finale di 250 microlitri.
    3. Re-suspestremità 50 ml di cellule in RPMI 1.640 a sei volte la densità finale desiderato.
    4. Mescolare per sospensione cellulare con miscela di collagene per creare un volume finale di 300 ml con una pipetta P200.
    5. Utilizzando una pipetta manuale o ripetitore, depositare una goccia 8 ml di cellulare finale mix / matrice al centro di ogni bene in piastre da 384 pozzetti, o 2 ml in ciascun pozzetto di 1.536 pozzetti (Vedere il punto 2.6 per un esempio di disposizione spaziale di pozzi).
    6. Piatto di centrifuga per 2 min a 500 xg per concentrare tutte le celle sullo stesso piano focale durante l'imaging.
    7. Lasciare piastra in un incubatore (5% CO 2, 37 ° C) per 1 ora, per polimerizzazione del gel.
    8. Aggiungere 80 ml di terreni di crescita integrato (RPMI-1640, 10% FBS, 10% HI derivati ​​dal plasma del paziente, 1% P / S) a ciascun pozzetto in 384 pozzetti piastre o 8 ml in piastre 1.536 pozzetti.
    9. Lasciare piastra O / N in incubatore (5% CO 2, 37 ° C) per l'adesione di stroma al fondo della piastra.
  5. Co-culture di cellule di MM primarie con HUVECs:
    1. Trasferimento matrice membrana basale da -80 ° C per un secchio con ghiaccio per scongelare.
    2. Contare e risospendere le cellule primarie e HUVEC in mezzi RPMI-1640 a 4 volte la densità finale, ciascuna in un tubo separato.
    3. Mescolare le cellule del paziente e volumi HUVECs alla proporzione 1: 1.
    4. Una volta matrice membrana basale è scongelato, ma ancora non polimerizzato, mescolare 1: 1 con la miscela delle cellule dal passaggio precedente.
    5. Gocce di semi con un adeguato volume di mix cellula-matrice al centro di ogni bene (8 ml per 384 pozzetti e 2 ml per piastre 1.536 pozzetti, vedere il punto 2.6 per un esempio di disposizione spaziale dei pozzi).
    6. Piatto di centrifuga a 500 xg per 10 min.
    7. Posizionare la piastra in incubatrice (5% di CO 2, 37 ° C) per 1 ora per la polimerizzazione della matrice.
    8. Aggiungere terreni di coltura (RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% di plasma del paziente e 1% P / S) a ciascun pozzetto (80 microlitri per 384 pozzetti, 8 microlitri per 1,5Piastre 36 pozzetti).
    9. Lasciare piastra O / N in incubatore (5% CO 2, 37 ° C) per l'adesione del HUVECs al fondo della piastra.
  6. Seed una piastra a 384 pozzetti. La figura 3 illustra una tipica distribuzione spaziale di semina.
    1. A partire dal B2 bene, sementi tante colonne come farmaci da testare. Nell'esempio di figura 3, utilizzare sette farmaci.
    2. Ripetere semina le volte concentrazioni da utilizzare. Nell'esempio in figura 3, utilizzare cinque concentrazioni.
    3. Seed altri quattro pozzi per condizioni di controllo.
    4. Ripetere i punti 2.6.1 e 2.6.2 per la seconda replica.
    5. Ripetere i passaggi da 2.6.1 a 2.6.4 per ogni campione del paziente da testare nel piatto.
    6. Seed una linea cellulare MM in due linee di pozzetti, ciascuno con altrettanti pozzetti come farmaci da testare (in duplicato). Ognuno di questi pozzetti saranno trattati con la più alta concentrazione di ogni farmaco per garantire che il supporto utilizzato aveva adeguata potency (vedi figura 3, per esempio).
    7. Seme due pozzetti con una linea cellulare MM per servire come controllo delle condizioni sperimentali, quali il corretto funzionamento del top incubatore panchina, terreni di coltura, ecc.

3. Semina Cellule Piatti (usando un Robotic Pipettor)

Nota: Questa serie di passi semi una piastra da 384 pozzetti con una pipetta robotica. Il disegno della piastra è raffigurato in figura 1 supplementare, in cui le cellule MM primarie vengono provati su un pannello di 31 farmaci diversi in cinque diverse concentrazioni in due repliche, più controllo negativo. Una linea cellulare è anche seminata come controllo positivo per la valutazione della efficacia dei farmaci e testato contro tutti i 31 farmaci a più alta concentrazione, in due repliche. I file forniti sono per una particolare marca e modello (vedi tabella Materials) ma l'algoritmo possono essere adattati a qualsiasi pipettatori robotici.

  1. Co-coltura di cellule primarie MMs con BMSCs:
    1. Preparare una provetta da 15 ml composta da 240 ml di 10x MEM, 240 ml di H 2 O deionizzata, 120 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio, 600 l di 1x RPMI 1.640 e 1,8 ml di 3,1 mg / ml di collagene di tipo bovino I. Label tubo come "pre-mix per CD138 +". Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    2. Preparare una provetta da 1,5 ml composto da 50 ml di 10x MEM, 50 ml di H 2 O deionizzata, 25 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio, 125 l di 1x RPMI 1.640 e 375 microlitri di 3.1 mg / ml collagene di tipo bovino I. Label tubo come "pre-mix per Cell Line". Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    3. Risospendere 300 ml di cellule CD138 + in RPMI 1.640 a sei volte la densità finale desiderato. Risospendere 300 ml di cellule BMSC in RPMI 1640 a sei volte la densità finale desiderato. Mescolare i due volumi insieme in una provetta da 1,5 ml e l'etichetta "CD138 +". Mettere in incubatrice fino al momento dell'uso.
    4. Risospendere 60 ml dilinea cellulare in RPMI 1640 a sei volte la densità finale desiderato. Risospendere 60 ml di cellule BMSC in RPMI 1640 a sei volte la densità finale desiderato. Mescolare i due volumi insieme in una provetta da 1,5 ml e l'etichetta "Cell Line". Mettere in incubatrice fino al momento dell'uso.
    5. Utilizzando il software fornito con la pipetta robotica, caricare il primo file di script, "cell_seedingPt47.PGM". Posizionare una casella 200 microlitri punta della pipetta, una piastra di microtitolazione e sterile 384 pozzetti nelle stazioni A, B ed E, rispettivamente, del robot.
    6. Mescolare il contenuto dei tubi "pre-mix per CD138 +" e "CD138 +". Trasferire 1,5 ml del suo contenuto al pozzo # 1 della micropiastra. Posizionare il tubo con volume restante sul ghiaccio. Avviare il programma. Il robot seme i primi 176 pozzi (11 colonne più a sinistra) della piastra a 384 pozzetti e poi pausa. Trasferire il residuo del tubo sul ghiaccio per ben # 2 di micropiastra. Riprendere il programma. Ilrobot seminare i restanti 144 pozzetti della piastra a 384 pozzetti e la pausa.
    7. Mescolare il contenuto dei tubi "pre-mix per Cell Line" e "Cell Line" e trasferire il contenuto di ben n.3 micropiastra. Riprendere programma. Il robot seme restanti 64 pozzetti della piastra da 384 pozzetti.
    8. Posizionare piastra a 384 pozzetti in centrifuga per 10 minuti a 500 xg e 4 ° C. Piastra di trasferimento di incubatrice (5% CO 2, 37 ° C) per 1 ora per il collagene polimerizzazione.
    9. Caricare il secondo file di script, "media_layer.PGM". Mettere 120 ml di dialogo puntale, un serbatoio di reagente con 31 ml di RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% del plasma del paziente e l'1% P / S, e la piastra 384 pozzetti con cellule in stazioni A, B ed E, rispettivamente. Eseguire il programma. Il robot trasferirà 81 ml di media per ogni bene. Una volta terminato, il trasferimento piastra a 384 pozzetti per incubatrice e consentire stroma di aderire al substrato O / N.

Preparazione 4. Droga e somministrazione di psicofarmaci Piastre (utilizzo di un manuale Pipetta multicanale)

  1. Preparare un modello simile alla figura 3, al fine di facilitare il processo di aggiunta di farmaco per pozzi e ridurre la possibilità di confusione.
  2. Preparare, in una piastra a 96 pozzetti, una diluizione seriale di ciascuno dei farmaci da testare nella piastra, per esempio, per cinque concentrazioni utilizzando una diluizione di 3 volte:
    1. Aggiungere 120 ml di droga a 10 volte la concentrazione desiderata nella più alta concentrazione di bene. Ad esempio, utilizzare 500 pM melfalan se la più alta concentrazione le cellule saranno esposte nella piastra sarà di 50 pM.
    2. Aggiungere 80 ml di terreni di crescita (RPMI supplementato con 10% FBS, 10% derivato dal plasma paziente e 1% di penicillina / streptomicina (P / S)) a quattro pozzetti successivi.
    3. Trasferimento 40 microlitri dal primo pozzo alla seconda e mescolare, fino ad un volume totale di 120 microlitri a 1/3 della concentrazione del farmaco prima del pozzo, o 167 mM.
    4. Ripetere il punto 4.2.3 ai rimanenti pozzetti (per esempio, trasferire 40 microlitri dal secondo al terzo, mescolare, poi trasferire 40 microlitri dalla terza alla quarta, ecc.);
  3. Trasferire 8 microlitri di ciascun farmaco contenente bene al corrispondente pozzetto nella piastra di cella. Ogni farmaco contenente bene dovrebbe avere un volume sufficiente per 10 pozzi nella piastra di cella. Nell'esempio di figura 3, ciascuna concentrazione di farmaco viene aggiunto a 6 differenti pozzetti, eccetto la più alta concentrazione, che si aggiunge a 8 pozzetti.
  4. Aggiungere 8 ml di terreni di crescita (RPMI supplementato con 10% FBS, 10% derivato dal plasma paziente e 1% P / S) ai pozzetti di controllo.
  5. Cellule posto in microscopio appena pronto e accendere l'incubazione da banco.

Preparazione 5. Droga e somministrazione di psicofarmaci Piastre (utilizzo di un robot Pipettor)

  1. Scaricare file di script per pipettatore robotica da http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
  2. Caricare lo script "media_layer_DRUGPLATE.PGM" nell'interfaccia utente pipetta robotica. Posizionare una casella di punta della pipetta 120 microlitri, serbatoio con 21 ml di RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% del plasma del paziente e l'1% P / S e una piastra a 384 pozzetti vuoto nelle stazioni A, B ed E, rispettivamente. Eseguire il programma, la pipetta robotico aggiungerà 30 ml di mezzi di comunicazione per tutti i pozzetti nella piastra da 384 pozzetti.
  3. Seguendo il modello dal Supplemental figura 2 aggiungere 200 ml di droga a 20x concentrazione massima per ciascun pozzetto di una micropiastra. Questa configurazione può ospitare fino a 31 farmaci. Per il pozzetto di controllo (CTRL), aggiungere RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10% del plasma del paziente e l'1% P / S.
  4. Posizionare una casella di punta della pipetta 120 microlitri, micropiastra con farmaci a 20X concentrazione e 384 pozzetti con i media (dal punto 5.1) nelle stazioni di A, B e C, rispettivamente. Caricare il programma "drug_plate.PGM". La pipetta robotica creerà una diluizione serialedi 1: 3, a seguito della distribuzione spaziale in riferimento figura 1.
  5. Posizionare una casella di punta della pipetta 120 microlitri, la piastra a 384 pozzetti con diluizione droga (dal punto 5.3) e la piastra di 384 pozzetti con le cellule (dal punto 3.1.9) in stazioni A, B e C, rispettivamente. Carico ed eseguire il programma "drug_add.PGM". Il pipettatore robotico trasferirà 8 ml di farmaco da ciascun pozzetto nella piastra farmaco sua controparte nel piastra di cella. Una volta terminato, trasferire piastra di cella per l'incubatore del microscopio digitale non appena possibile.

6. Imaging di celle a Piatto

Nota: La seguente procedura si applica al microscopio Evo Auto FL, ma può essere facilmente adattato ad altri microscopi stadi motorizzati con panca superiore incubazione o microscopi incubatore-embedded.

  1. Pulire l'interno della parte superiore incubatore panchina con etanolammina-wipe e rimuovere con attenzione il coperchio della piastra mentre si posiziona il coperchio del incubator.
  2. Seguire i passaggi di software per aggiungere i fari. Questo è il termine usato per riferirsi a punti di riferimento per le regioni di interesse, per essere ripreso successivamente durante l'esperimento (vedere il manuale utente del software per i dettagli).
  3. Utilizzare un obiettivo di ingrandimento 5X e 10X. Assicurarsi che l'obiettivo è simile alla figura 2: cellule di MM appaiono i dischi come luminosi, circondati da un anello scuro e BMSCs o HUVECs sono appena visibili. Alcune cellule di MM primarie sono molto piccole e quindi una messa a punto potrebbe essere necessario per trovare la messa a fuoco ottimale.
  4. Regolare l'intervallo di acquisizione tra i 10-30 minuti e per la durata di almeno 96 ore. Mentre intervalli più lunghi tra le acquisizioni sono accettabili, intervalli di 45 minuti o più possono ridurre in modo significativo la precisione della misura della vitalità.
  5. Configurare il software in modo che le immagini di ogni bene sono memorizzati in file separati chiamati Beacon-1, Beacon-2, ecc Se è stata utilizzata la pipetta robotica, impostare i fari nell'ordine rappresentato inSupplemental Figura 3.
  6. Assicurarsi che ci sia abbastanza acqua nel umidificatore incubatore e il gas, in modo che le cellule saranno in condizioni ottimali.
  7. Al termine dell'esperimento, copiare le cartelle contenenti le immagini al computer che eseguirà l'analisi.

7. Quantificazione del Drug Sensitivity

Nota: Le seguenti istruzioni l'uso dell'analisi immagine utilizzando un cluster di computer, poiché l'analisi di una piastra multi-pozzo in un personal computer è estremamente lungo.

  1. Scarica il software ImageJ dal sito di NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
  2. Scaricare lo script e plugin a http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
  3. Seguire le istruzioni in http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf per eseguire il software di analisi di immagine digitale. Il risultato dovrebbe essere un foglio di calcolo denominato Results.csv contenente le misure di vitalità ad intervalli regolari per each pozzetto nella piastra per tutta la durata dell'esperimento (cioè, 96 ore).
  4. Se si utilizza un manuale pipetta multicanale, effettuare le seguenti operazioni.
    1. Scaricare il file http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt e modificarlo in base al layout del piatto definito nel punto 3.1 (ad esempio, figura 3).
    2. Scaricare il software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar ed eseguirlo utilizzando i file creati in passi 5.3 e 5.4 come parametro di ingresso. Il risultato sarà un Rapporto nome di una cartella contenente più fogli di calcolo, ogni raggruppamento i risultati di un particolare farmaco.
    3. Copiare e incollare il contenuto in modello di foglio di http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      Nota: Il risultato dovrebbe essere grafici come quello illustrato in figura 4, che rappresenta la chemiosensibilità del campione diversi farmaci in funzione della concentrazione del farmaco e del tempo di esposizione.
    4. Se si utilizza una pipetta robotica, effettuare le seguenti operazioni.
      1. Scaricare file di modello da Scaricare file di script per pipettatore robotica da http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip ed estrarre i file in una directory.
      2. Modificare il file DrugList.csv secondo l'elenco dei farmaci e la concentrazione più alta di droga nel piatto con le cellule. Seguire il layout del Supplemental figura 2.
      3. Eseguire il programma BuildExperimentalDesign.java passando come parametro la cartella contenente i file estratti nel passaggio 7.5.1 ei file Results.csv dal punto 7.3. Il risultato dovrebbe essere due cartelle citarne MM1_S e PtSample. La prima contiene una descrizione dei pozzi (farmaci e concentrazioni) per il controllo positivo linea cellulare. La seconda contiene le stesse informazioni, ma per quanto riguarda la parte della piastra seminati con cellule di pazienti.
      4. Copiare il file Results.csv in ognuna delle directory create nella fase 7.5.3. Scaricail software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar ed eseguirlo utilizzando i file creati nei passaggi 7.5.3 per entrambe le cartelle. Il risultato sarà un nome di cartella report in ciascuna delle cartelle create in 7.5.3. La cartella Rapporto contiene più fogli di calcolo, di ciascuna classe i risultati per un particolare farmaco.
      5. Eseguire il programma BuildGraphPadFile.java e passare come parametro la cartella contenente i file estratti nel passaggio 7.5.1 ei file Results.csv dal punto 7.3. Il risultato sarà un file GraphPad contenente le curve dose-risposta per ciascuno dei 31 farmaci, e normalizzati dal controllo. Ogni grafico conterrà 5 concentrazioni del farmaco per le cellule di MM primarie e una concentrazione per il controllo della linea cellulare positiva.

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Risultati

Il flusso di questo esperimento è brevemente descritto nella Figura 1 Se tutti i passaggi sono stati completati con successo, le immagini ottenute con il microscopio dovrebbe essere equivalente alla Figura 2:. Vivono cellule di MM devono essere chiaramente visibili come dischi luminosi e BMSCs o HUVECs dovrebbero essere appena visibile e ben distribuita in background. Come si vede nella figura 2A, cellule di MM variano nel formato da un paziente all'altro, ma in gen...

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Discussione

In sintesi, questo è un metodo di throughput potente e alta quantificare chemiosensibilità delle cellule MM primarie ed ex vivo farmacodinamica dei farmaci in una ricostruzione del midollo osseo. I passaggi critici all'interno questo protocollo sono il corretto semina dei pozzi e focalizzazione adeguata (vedi Figura 2 per i risultati attesi): assicurare che le cellule stromali MM e sono uniformemente distribuiti, che le cellule stromali sono aderenti al fondo del pozzo, che tutti MM cellule...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dallo Stato della Florida Bankhead-Coley Science Team Grant (2BT03), il National Institutes of Health / National Cancer Institute (1R21CA164322-01) e del Moffitt Cancer Center Science Team Grant. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Fondo ricerca traslazionale core al H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, un NSC designato Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292). L'accesso alle cellule primarie è stato reso possibile grazie alla Total Cancer Care protocollo presso il Moffitt Cancer Center.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
EVOS FL AUTOAMGAMAFD1000+ AMC1000Microscopio digitale dotato di tavolino motorizzato e incubatore da banco.
piastra a 384 pozzetti CellBindCORNING CLS3683SIGMACorning CellBIND piastre a 384 pozzetti
piastra a 384 pozzetti, polistirene, superficie CellBIND, sterile, fondo piatto trasparente, nero, con coperchio
piastra a 1.536 pozzetti CellBindCORNING CLS3832ALDRICHCorning piastre a 1.536 pozzetti, base bassa, trattamento superficiale CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus GE HealthcareGE17-1440-02 SIGMAPer in vitro isolamento di linfociti dal sangue periferico umano.
CD138 perline magneticheMiltenyi 130-051-301Sfere magnetiche coniugate anticorpali per la selezione di cellule CD138+.
Colonne LSMiltenyi   130-042-401Colonna per la separazione delle celle.
Separatore MidiMACSMiltenyi 130-042-302Magnete per colonna di separazione.
MatrigelSigma-AldrichE6909 SIGMAECM Gel di Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma murino
GetrexLife TechnologiesA1413201senza LDEV Fattore di crescita ridotto Matrice della membrana basale
HUVECLife TechnologiesC-003-25P-BCellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)
RPMI-1640 mediaGIBCO11875-093RPMI 1640 Medium + L-Glutammina + Rosso Fenolo
FBS Inattivato a caldoGIBCO10082-147Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, origine statunitense
3,1 mg/ml Collagene bovino di tipo ISoluzione avanzata diBiomatrix 5005-B, Tipo I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XSBIOTEKPRC3841 Sistema di pipettatori robotizzato
collagene bovino

Riferimenti

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