Fastställande Ultraljuds vocalization Inställningar i möss med användning av en två-val uppspelning test

Summary

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

Abstract

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.

First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

Introduction

Många djur använder läten för intraspecifik kommunikation. I musen Mus musculus, en viktig typ av kommunikationssignal är ultraljud läten (USVs), som har frekvenser högre än 20 kHz. USVs avges av möss betraktas som en del av socialt erkännande i manligt-kvinnligt ^1-4, hona-hona ^{1, 5,} och hane-hane ^{1, 6} interaktioner. USVs släpps även ut från valpar när de är isolerade från sin mamma, vilket ökar hennes valp-hämtning beteende, och därför överlevnad ^7. Även om många rapporter har analyserat och kategoriseras mus USVs ^{8, 9,} beteende svar och neurala mekanismer i den mottagande djuret har mindre dokumenterat ^{10, 11.} Det senare är nödvändigt att klargöra den biologiska betydelsen av de olika egenskaperna hos USVs. För att visa dessa mekanismer, är uppspelningsexperiment en effektiv metod. Nyligen genomförda studier uppspelning har visat att kvinnormöss lockas till USVs ^12, och att de föredrar USVs från män som skiljer sig från sina föräldrar ^{13, 14.}

Den här artikeln förklarar test uppspelning används för att utvärdera USV företräde hos möss. En två-val testlåda har utvecklats i vilka två olika USVs kan spelas upp samtidigt i två avdelningar av en test hölje, såsom visas i figur 1. Denna typ av test box förhindrar ljudförorening genom att dividera testområdet i tre underkammare , med hjälp av bly väggar. Ultraljudssändare finns utanför varje rum. I väggen mellan rummen och ultraljudssändare finns hål täckt med metallnät. Möss kan röra sig fritt i de tre rummen, och visar en "söka på nätet" beteende, som om att svara på USVs spelas upp av ultraljudssändare. Vid detta test möss bo för perioder av olika varaktighet nära en ljudsändare eller det andra. Dessa parametrar kan loggas för att erhålla ett känsligt measu re av ljud önskemål.

Att spela USVs tillbaka, nanokristallinska kisel termoakustiska sändare (dvs "nc-Si emitter") användes som i tidigare studier ^15-17. Dessa anordningar består av ett tunnfilmsvärmare elektrod, en nanoporöst kiselskiktet, och en enda kristallin kiselskiva. Den digitala ljudfilen omvandlas till en analog signal och sedan leds genom värmaren elektroden. Enheten omvandlar de resulterande spänningsberoende termiska signaler till betydande ljudtryck med låg distorsion. Denna anordning är unikt genom att, till skillnad från vanliga ljudgeneratorer som är beroende av mekaniska vibrationer kan den reproducera ljud utan behov av ett membran. Sändaren uppvisar en platt ljudtrycksnivå vid frekvenser från 20 till 160 kHz (Figur 2), och kan reproducera digitalt inspelade murina USVs mycket noggrant när det gäller varaktighet, frekvens och ljudtrycksnivå ^{15, 18, ​​19.}

ve_content "> I ett representativt experiment som visas i figur 3, var C57BL / 6 (B6) honor tillåtas att välja mellan BALB / c-(BALB) manliga USVs och bakgrundsbrus. Dessutom visar figur 4 valet av B6 och BALB kvinnor mellan samtidiga UPS-uppspelningar från en BALB och B6 hane, som rapporterats i en tidigare studie ^14. Egenskaperna hos manliga USVs skiljer mellan B6 och BALB stammar ^20. Som framgår av dessa resultat, kan attraktionskraft USVs bedömas med det nuvarande protokollet, där ljud spelas in från en levande individ, akustiskt analyseras och spelas upp för andra individer.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av den etiska kommittén i Azabu University. Alla experiment utfördes i ett ljudisolerat kammaren. 1. Animal Förberedelse Handjur för inspelning Skaffa könsmogna hanmöss upplevt i parning. Kvinnliga försökspersoner Skaffa jungfru kvinnliga möss som har inhysts med 2 till 5 kullsyskon per bur (vanligen 8 – 12 veckor gamla). Skaffa vaginala smetar dagligen för att bestämma fasen hos estrous …

Representative Results

De USVs spelats in från en BALB-hane (161 stavelser per 20 sek), samt bakgrundsbrus användes som uppspelning ljud i representativt experiment visas i Figur 3. I detta experiment, var 7 kvinnliga B6-möss användes vid 9 veckors ålder . För att bestämma den bästa varaktighet för försöket av kvinnlig respons vill spela upp ljud, var de beteendeparametrar analyseras separat för de första och sista fem minuter av den totala 10 min provtid. Först fanns det ingen signi…

Discussion

Here, the results of a representative test showed that female mice can discriminate between artificial male USVs and background noise (Figure 3). The conclusion to be drawn from these results is that the discrimination signal is reflected in the duration of stay in the room and sound zone, and in the duration of searching the mesh in the first 5 min of testing, but not in the second 5 min (Figure 3C, E and F). These data indicate that mice become habituated to the playback sounds, possib…

Materials

Soundproof chamber	Muromachi Kikai
Small cage	CLEA Japan	CL-0113-1
Middle cage	CLEA Japan	CL-0103-1
Ultrasound condenser microphones	Avisoft Bioacoustics	CM16/CMPA
A/D converter	Avisoft Bioacoustics	UltraSoundGate116H
Audio software	Avisoft Bioacoustics	RECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing software	Adobe Systems	Adobe Audition 3.0
Nc-Si emitter	Original		not commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converter	National Instruments	NI USB-6251 BNC
Attenuator	Original
Amplifier	Yamatake
PC	Windows 7 professional		Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring software	original		Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin)	Tokyo bouon	TI-75BK B4	Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solution	Merck Millipore	1.09204.0500