Kontraktilitet Målinger på Isolerte papillemusklene for Undersøkelse av Cardiac inotropi i Mus

Summary

Murine venstre ventrikkel papillær muskel kan brukes til å undersøke kardial kontraktilitet in vitro. Denne artikkelen beskriver i detalj isolering og eksperimentelle protokoller for å undersøke hjerte kontraktile egenskaper.

Abstract

Papillære muskel isolert fra voksne mus hjerter kan brukes til å studere hjertets kontraktilitet i ulike fysiologiske / patologiske tilstander. Sammentrekningene egenskaper kan vurderes uavhengig av ytre påvirkninger som for eksempel vaskulær tonus eller neurohumoral status. Det viser en vitenskapelig tilnærming mellom encellete målinger med isolerte hjertemuskelceller og in vivo studier som ekkokardiografi. Således papillære muskelpreparater tjene som en utmerket modell for å studere kardial fysiologi / patofysiologi og kan anvendes for undersøkelser som modulasjonen av farmakologiske midler eller utforskningen av transgene dyremodeller. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å isolere den murine venstre fremre papillarmuskel å undersøke hjertets kontraktilitet i et organbad oppsett. I motsetning til en muskel strimmel forberedelse isolert fra den ventrikulære veggen, kan den papillære muskelfremstilles in toto uten å skade muskelen tissue alvorlig. Orgelet bad oppsettet består av flere temperaturkontrollerte, gasset og elektrode utstyrt organ bade kamre. Det isolerte papillarmuskel er festet i organbadet kammeret og elektrisk stimulert. Den fremkalte rykk Kraften registreres ved hjelp av en trykktransduser og parametere som rykk og napp kraft amplitude kinetikken blir analysert. Forskjellige eksperimentelle protokoller kan bli utført for å undersøke kalsium- og frekvensavhengig kontraktilitet samt doseresponskurver av kontraktile midler slik som katekolaminer eller andre farmasøytiske midler. I tillegg kan patologiske tilstander som akutt iskemi simuleres.

Introduction

Undersøkelsen av proteiner som ionekanaler referer deres rolle for hjertets kontraktilitet er viktig å oppdage forskjellige pathomechanisms og for å etablere nye terapeutiske strategier for hjertesykdommer slik som iskemi og hjertesvikt.

Kontraktile funksjon av pattedyr kardiomyocytter er kjent for å bli modulert ved forskjellige ionekanaler, transportører og andre proteiner. Aksjonspotensial fremkalt aktivering av spenningsavhengige sarcolemmal L-type Ca ²⁺ kanaler fører til Ca ²⁺ tilstrømningen fra ekstracellulære rom og senere til Ca ²⁺ -indusert Ca ²⁺ frigjøring (CICR) ^1, som utløser cellular sammentrekning ^to. Ca ²⁺ -signaling spiller en sentral rolle i hjertekontraksjonen og tilpasning til fysiologisk eller patologisk stress. Katekolaminer aktivere kardiale p-adrenerge reseptorer, og dermed stimulere adenylylcyklase (AC) som syntetiserer cAMP. Aktiveres, Proteinkonn kinase A (PKA) phosphorylates ulike intracellulære og membran assosierte proteiner som L-type Ca ²⁺ kanaler, phospholamban og ryanodine reseptorer resulterer i endring av Ca ^{2 +} transienter og hjertekontraktilitet ^1,3,4. cAMP forringes av fosfodiesterase (PDE). Aktivering av Gs-koblete reseptorer enn p-adrenerge reseptorer også fører til akkumulering av cAMP.

Teknikken med kontraktilitet målinger i isolerte ventrikulære muskelstriper er vel etablert for større pattedyr ^5-8. På bakgrunn av muligheten for målretting genet i mus er det viktig å etablere metoder for å analysere murine hjerte fysiologi. Men eksisterende data om de fysiologiske egenskapene til isolerte muskel preparater i mus varierer avhengig av eksperimentelle forhold ^9-12.

Den beskrevne metoden brukes til å analysere hjertets kontraktilitet av venstre ventrikkel papillær muskel preparations in vitro. Undersøkelse av hjertets kontraktilitet utføres i fravær av påvirkning modifiser hjertets kontraktilitet in vivo, slik som blodtrykk, neurohumoral stimulering og fysisk eller metabolsk stress. Juling frekvensen av oppdragsgiver muskel forberedelse kan være strengt definert og endret vilkårlig. Nappe kraft kan analyseres i sammenheng med spesifikke stimuli slik som kalsiumkonsentrasjon, slo frekvens eller temperatur. I tillegg kan denne fremgangsmåte benyttes til å undersøke ulike komponenter signalveien, og til å sammenligne hjertefunksjon av genetisk modifiserte musemodeller ved å kontrollere forsøksbetingelser som er nevnt ovenfor.

Protocol

MERK: De grunnleggende trinn i isoleringsprosedyren er vist i figur 1. Alle trinn er beskrevet i detalj i den følgende protokoll.. Papillemuskel isolering, montering i organbad kammer, innsamling og analyse er utført i en sammenhengende og obligatorisk tidsskala. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til tysk lovgivning om vern av dyr og ble godkjent av Etisk Review Board of Universitetet i Heidelberg. 1. Utarbeidelse av Instrum…

Representative Results

Protokollen fra dette manuskriptet for kontraktilitet målinger av isolerte murine papillarmuskel forberedelser er innstilt til optimale forhold for å oppnå reproduserbare eksperimentelle resultater under fysiologiske forhold. For å definere optimale forsøksbetingelser vi gjennomført pilotforsøk varierende organbad temperatur og ekstracellulært kalsium konsentrasjon (se også 12). Protokollen er beskrevet her ble utført med en ekstracellulær kalsiumkonsentrasjon på 1,5 mM og en temperatur på 32 ° …

Discussion

I dette manuskriptet beskriver vi en fremgangsmåte for å undersøke kontraktilitet av murine papillære muskel in vitro, som kan brukes til å svare på flere vitenskapelige spørsmål relatert til hjerte fysiologi og patologi hos mus, samt å understøtte analyse av transgene linjer og oppdagelsen av nye farmasøytiske tilnærminger å behandle hjerte dysfunksjoner. Vi illustrerer bruken av denne metoden for å vurdere fysiologiske, patologiske og farmakologiske egenskapene til hjertemuskelen kontraktilitet …

Materials

Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Forskolin	Sigma-Aldrich	F3917	Hazard statement H312, solve in DMSO
3-?Isobutyl-?1-?methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10ml	ratiopharm	PZN 3874685
Histamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	H7250	Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335