El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

Resumen

Caco-2 pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos y fármacos/vitaminas liposolubles en lípidos. El sistema de membrana permeable separa el compartimento apical del basolateral, mientras que el sistema de expresión de lentivirus ofrece un método eficaz de sobreexpresión génica. El aislamiento de lipoproteínas está confirmado por TEM.

Resumen

Los estudios de absorción de grasa en la dieta generalmente se realizan utilizando un modelo animal equipado con una cánula linfática. Aunque este modelo animal es ampliamente aceptado como el modelo in vivo de absorción de grasas en la dieta, las técnicas quirúrgicas involucradas son desafiantes y costosas. La manipulación genética del modelo animal también es costosa y requiere mucho tiempo. Podría decirse que el modelo alternativo in vitro es más asequible, ahorra tiempo y es menos desafiante. Es importante destacar que el modelo in vitro permite a los investigadores examinar los enterocitos como un sistema aislado, lo que reduce la complejidad inherente a todo el modelo de organismo. Este artículo describe cómo las células de carcinoma de colon humano (Caco-2) pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos, fármacos liposolubles y vitaminas. Explica el mantenimiento adecuado de las células Caco-2 y la preparación de su mezcla lipídica; y además discute la valiosa opción de utilizar el sistema de membranas permeables. Dado que las células Caco-2 diferenciadas están polarizadas, la principal ventaja de utilizar el sistema de membrana permeable es que separa el compartimento apical del basolateral. En consecuencia, la mezcla de lípidos se puede agregar al compartimento apical, mientras que las lipoproteínas se pueden recolectar del compartimento basolateral. Además, se discute la efectividad del sistema de expresión de lentivirus en la regulación positiva de la expresión génica en células Caco-2. Por último, en este trabajo se describe cómo confirmar el aislamiento exitoso de lipoproteínas intestinales mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Introducción

Los estudios de absorción intestinal de grasas en la dieta, y las drogas y vitaminas solubles en lípidos pueden llevar a cabo in vivo mediante el uso de un modelo de fístula linfática ^{de 1 - 4.} Sin embargo, las técnicas quirúrgicas que participan no sólo son un reto, pero también costoso. Aunque in vivo enfoques basados ​​en el análisis fecal pueden ser utilizados, que se utilizan principalmente para determinar el porcentaje de absorción por el tracto gastrointestinal ^2,5. El modelo in vitro descrito en este artículo es más rentable, y las técnicas utilizadas son sin duda menos difícil. Estudios de modificación genétic....

Protocolo

1. Mantenimiento de las células Caco-2

1. El uso de platos regulares de cultivo de tejidos
   1. Descongelar las 2-Caco células de un vial congelado colocando el vial en un baño de agua a 37 ° C, e inmediatamente añadirlos a una placa de cultivo tisular de 10 cm que contenía 10 ml de medio de crecimiento (suero bovino fetal pre-calentado 15% (FBS ) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)).
      1. Cuando las células Caco-2 han llegado a 50-70% de confluencia, ellos dividido 1: 6 mediante la incubación de las células con 3 ml de 0,05% / 0,53 mM de ácido etilendiaminotetraacético Tripsina (EDTA) a 37 ° C hasta que se separan (15 min) . Para evitar la f....

Resultados

Figura 13-días post-confluentes células normales Caco-2 1 muestra. La aparición de estructuras en forma de cúpula y las gotas de lípidos intracelulares son característicos de diferenciadas Caco-2 células. Cuando las células Caco-2 no se dispersan igualmente durante la siembra, se aglutinan y crecer demasiado en ciertas áreas del plato; y habrá algunas áreas en el plato sin células. Remolina y colocando el plato en una superficie inclinada debe ser evitado. También es importante señalar .......

Discusión

En este papel, los dos sistemas que se pueden utilizar para mantener las células Caco-2 se describen, a saber, el plato de cultivo de tejido normal y la membrana permeable. Los beneficios de usar el sistema de membrana permeable incluyen la separación de la apical y basolateral de los compartimentos, y la capacidad de incubar la mezcla de lípidos y recoger la secreción de lipoproteínas de forma simultánea. Sin embargo, los insertos de membrana permeable son caros, y su membrana de policarbonato no permite una buena visi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	VWR	16750-112	Precaliente el medio de crecimiento en una placa de cultivo de tejidos individual antes de agregar las células
FBS	Fisher	3600511	No inactivamos por calor nuestro suero
Tripsina	VWR	45000-660	Las células se pueden lavar con PBS antes del tratamiento con tripsina
Sistema de membrana permeable	Fisher	7200173	plato de 10 cm, tamaño de poro de 3 mm, membrana de policarbonato
10 cm	Fisher	08-772-E plato de cultivo de	tejidos
15 cm	Fisher	08-772-24 Plato de	cultivo de tejidos
24 pocillos	Fisher	12565163	Placa
de cultivo de tejidos Reactivo de transfección a base de lípidos	Fisher	PRE2691	Puede sustituirse por otro reactivo de transfección
Medios de suero reducidos	Invitrogen	11058021	Para la transfección
pLL3.7 eGFP	Addgene	11795	https://www.addgene.org/11795/
Filtro de tapa de botella	Fisher	9761120	poro de 0,45 mm
Polybrene	Fisher	NC9840454	10 mg/ml
Ácido oleico	Sigma	01383-5G	Prevenir el ciclo de congelación-descongelación
Lecitina	Fisher	IC10214625	Lecitina de huevo
Taurocolato de sodio	Fisher	NC9620276	Producto descontinuado; Número de catálogo alternativo: 50-121-7956
Tableta de cóctel inhibidor de proteasa (sin EDTA)	Fisher	5892791001	Se utiliza principalmente para muestras que necesitan análisis TEM
Tubo de ultracentrífuga de policarbonato	Fisher NC9696153		Si lo utilizas varias veces, colapsarás el tubo
Tapa para tubo de ultracentrífuga	Fisher	NC9796914	Se requiere una herramienta para quitar el tubo/tapa del rotor
Jeringa	Fisher	50-949-261	Desechable Filtro
jeringa	Fisher	09-719C Tamaño de	poro = 0,2 mm; nylon
Ácido fosfotúngstico	Fisher	AC208310250	Para preparar ácido fosfotúngstico al 2%, pH 6.0
Pinza	Fisher	50-238-62	Extra fino y Consejos fuertes
Formvar/rejilla de carbono	Fisher	50-260-34	Formvar/rejilla cuadrada de película de carbono 400 Cobre

plato de plato de placa dede