Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Summary

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Abstract

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Introduction

Nanopartikler-baserede levering køretøjer har vist meget lovende for intracellulære målretning applikationer, der giver en mekanisme til specifikt at ændre cellulær signalering og genekspression. Disse køretøjer kan indlæses med lægemidler, proteiner og nukleinsyrer til formål at påvirke cellulære reaktioner og opnå en ønsket virkning i målvæv. Mange typer af nanocarriers er blevet udforsket til terapeutisk og diagnostisk fordel, herunder lipider, polymerer, silicium og magnetiske materialer. Disse systemer er attraktive på grund af deres potentiale til lokaliseret lægemiddelafgivelse, øget terapeutisk koncentration i målvæv, og reduktion af systemisk toksicitet.

Faste lipide nanopartikler (SLNs) er en velundersøgte eksempel på en nanopartikel leveringssystem, der er opstået som et lovende lægemiddel afgivelsesvehikel i de seneste år. SLNs kan let formuleres til flere applikationer, herunder bio-sensing ^1, kosmetik ^2, og therapeutic levering ^3-7. Deres anvendelighed skyldes det faktum, at de er sammensat udelukkende af resorberbare, ikke-toksiske lipider, hvilket resulterer i øget biokompatibilitet. Under syntesen, kan lipofile lægemidler inkorporeres i SLN køretøjer, og derved øge lægemiddelopløselighed og egnethed til parenteral indgivelse. SLN køretøjer også bidrage til at stabilisere indkapslede lægemidler, reducere deres nedbrydning og clearance, og maksimere terapeutisk virkning. Disse køretøjer er særligt velegnet til langtidsvirkende, præparater med kontrolleret frigivelse på grund af deres stabilitet ved kropstemperatur ^3,4,8,9. Det er vigtigt, indkapsling af lægemidler i lipidnanopartikler ændrer de iboende farmakokinetiske profiler af lægemiddelmolekyler. Dette giver en potentiel fordel ved at tillade kontrolleret frigivelse af lægemidler med et snævert terapeutisk indeks. Frigivelseshastigheden af ​​SLN-inkorporeret terapeutiske kan indstilles på grundlag af lipid nedbrydningshastigheden eller lægemidlet diffusionshastigheden ilipidmatrix.

SLNs er ofte konstrueret til at ophobe sig i bestemte målvæv. For eksempel, deres størrelse (typisk større end 10 nm) potenserer retention i kredsløbet, hvor utætte vaskulatur tumorvæv letter deposition. Desuden har rute for partikel administration vist sig at ændre biodistribution med potentiale til at målrette specifikke fysiologiske strukturer, såsom lymfeknuder ^10,11. Efter aflejring i målvæv, opnå passende cellulære interaktioner og eventuel internalisering af nanopartikler er udfordrende på grund af evnen af cellemembraner til selektivt at styre strømmen af ioner og molekyler ind og ud af cellen ^12. For at lette celleoptagelse, er det muligt at modificere nanocarriers med specifikke ligander, herunder peptider, små molekyler og monoklonale antistoffer ^13,14. Flere mekanismer, herunder både passiv penetration og aktiv transport af nanopartiklerover cellemembranen tidligere er blevet beskrevet ^3,12,15. Generelt er det blevet påvist, at celle-interaktioner nanopartikler er påvirket af de fysisk-kemiske egenskaber af nanopartikler herunder størrelse, form, overflade ladning og overfladekemi, foruden cellespecifikke parametre såsom celletype eller cellecyklusfase ^12.

En tidligere undersøgelse viste, syntesen af sub-10 nm SLNs for topiske ^{16 og} biomarkør afsløring applikationer ¹ hjælp faseomlejringstemperaturen (PIT) metode ^17. Dette er en blid syntese metode, hvor ² sammensætningen forbliver konstant, medens temperaturen gradvist ændres. Kontinuerlig omrøring af den opvarmede opløsning, efterhånden som den afkøles til stuetemperatur resulterer i en nanoemulsion. Denne proces resulterer i syntesen af SLNs med mindre partikelstørrelse ^1, end man tidligere rapporteret anvendelse af forskellige fremgangsmåder til syntese af lipid nanoparticles ^17-22. Den resulterende størrelse skala, mindre end 20 nm, giver en fordel for intracellulære målretning applikationer på grund af forøget overfladeareal og potentialet for forbedrede cellulære interaktioner.

En skematisk afbildning af SLNs, designet til at levere et fluorescerende farvestof eller terapeutisk, er vist i figur 1. De SLNs består af et lipid indre (f.eks lineær alkan) at tillade inkorporering af lipofile forbindelser (f.eks, farvestoffer eller terapeutiske) og et overfladeaktivt udvendige (f.eks lineær ionisk overfladeaktivt middel) omgivet af vand. I denne undersøgelse blev SLNs fyldt med et fluorescerende farvestof og anvendes som model til at undersøge partikel-celle-interaktioner. Primære humane dermale fibroblaster og mus dendritiske celler blev udsat for farvestof-loaded SLN over tid med henblik på at karakterisere interaktioner med hensyn til toksicitet og partikel-optagelse. A 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) assay blev UtiZed for at etablere passende dosering niveauer. Fluorescensmikroskopi og flowcytometri var to metoder, der anvendes til at undersøge partikel optagelse in vitro.

Figur 1. Skematisk af SLN viser de store bestanddele. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Behandling af SLNs Syntese af SLNs Bemærk: Brug PIT metode 1,17,20 at forberede sub-20 nm SLNs 1. Brug aseptisk teknik, bioreagenser eller cellekultur reagenser, og sterile materialer (dvs. pipetter, spatler, hætteglas etc.). Brug en biosikkerhed skab til syntese af SLNs (figur 2). Kombiner 0,6 mg fluorescerende farvestof (Nile Red (NIR), NIR koncentrationen er ca. 0,3 mg / ml) og 0,10 g heneicosan (Lipid, 5 væg…

Representative Results

PIT fremgangsmåde blev anvendt til at syntetisere SLNs og faseomlejringstemperaturen blev bestemt under anvendelse af et vandbad. Prøverne blev langsomt opvarmet og omrørt forsigtigt, indtil opløsningen viste sig klart. Faseomlejringstemperaturen for SLNs fremstillet ved anvendelse heneicosan lipid er 45 ° C. Tabel 1 opsummerer partikelstørrelsen, polydispersitet, smeltepunkt og latent smeltevarme for SLNs. De SLNs syntetiseres ved anvendelse af forarbejdningsbetingelserne beskrevet ovenfor result…

Discussion

I denne undersøgelse blev syntesen af ​​SLNs og deres anvendelighed til intracellulær målretning applikationer udforsket. Disse biokompatible nanopartikler har vist lovende som levering køretøjer til flere programmer, herunder drug delivery, gendæmpning og vaccineteknologier ^25-30. Ultra-små SLNs blev syntetiseret ved hjælp af en let proces, og deres samspil med primære hudceller og primære immunceller blev udforsket. SLNs var designet til at omfatte indkapsling af et fluorescerende farvestof (N…

Materials

Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo	—-	Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	—-	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	R&D Systems	415	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	R&D Systems	404	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.