Astrocytes की तीन आयामी Confocal morphometric विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
मस्तिष्क में glial कोशिकाओं के रूप में, astrocytes के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विविध कार्यात्मक भूमिका है। हानिकारक उत्तेजनाओं की उपस्थिति में, astrocytes उनके कार्यात्मक और संरचनात्मक गुणों, प्रतिक्रियाशील astrogliosis एक की हालत कहा संशोधित। इधर, astrocytes की रूपात्मक संपत्तियों के मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। इस प्रोटोकॉल शाखाओं की सतह क्षेत्र और एक अस्थिकणिका (अस्थिकणिका क्षेत्र) द्वारा कवर ऊतक, शाखाओं, सेल शरीर, और नाभिक सहित पूरे अस्थिकणिका, की मात्रा यानी 12 विभिन्न मापदंडों की मात्रा का ठहराव के साथ ही कुल लंबाई और नंबर शामिल हैं, तीव्रता अस्थिकणिका का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति immunoreactivity, और अस्थिकणिका घनत्व (संख्या / 1000 माइक्रोन 2) के। Volocity 6.3 मापन के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में इस प्रयोजन के लिए तीन आयामी (3 डी) कोंफोकल सूक्ष्म चित्र बनाया है, और 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस तरह के थे। Amyloid बीटा 1-40 के संपर्क में चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों </के साथ या एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप के बिना उप> (Aβ 1-40) विधि पेश करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस प्रोटोकॉल भी विवो में या इन विट्रो की स्थिति में या तो अन्य कोशिकाओं के 3 डी morphometric विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
स्वस्थ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, astrocytes रक्त प्रवाह, ऊर्जा चयापचय, synaptic समारोह और plasticity, और बाह्य आयन के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और न्यूरोट्रांसमीटर 1-3 homeostasis। इसके अलावा, astrocytes के विभिन्न हानिकारक उत्तेजनाओं और इस तरह के अतिवृद्धि, प्रसार और astrocytes 4,5 के कार्यात्मक remodeling के द्वारा होती है जो प्रतिक्रियाशील astrogliosis के माध्यम से आघात, संक्रमण, ischemia या neurodegeneration के रूप में असामान्य परिस्थितियों का जवाब।
रिएक्टिव astrogliosis उपचारात्मक उपायों के नैदानिक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए, ऊतकों में सूजन प्रतिक्रिया और मरम्मत की प्रक्रिया इंजीनियर और कर सकते हैं। तदनुसार, astrocytes सीएनएस प्रभावित रोगों की एक किस्म के लिए उपचारात्मक उपायों के लिए संभावित ठिकानों के रूप में पिछले दशकों के दौरान न्यूरोसाइंटिस्ट से ध्यान प्राप्त हुआ है।
Astrocytes सामान्य रूप से अच्छी तरह-डी के साथ एक ताराकार आकार दिया हैसोमा 6 चारों ओर फैल गया है कि efined शाखाओं। मस्तिष्क में कोढ़ की हालत में, अस्थिकणिका शाखाओं जटिल हो जाते हैं और amyloid बीटा (Aβ) की उपस्थिति में, उदाहरण के लिए, सूजन समाप्त होता है 7 दिखा।
यह लेख confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत astrocytes की 3 डी छवियों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रत्येक अस्थिकणिका के लिए बारह विभिन्न मात्रात्मक मापदंडों मापा गया: सतह क्षेत्रों और अस्थिकणिका क्षेत्र (एक अस्थिकणिका द्वारा कवर ऊतक), (शाखाओं सहित) पूरे सेल, सेल शरीर, और नाभिक की मात्रा; कुल लंबाई और शाखाओं की संख्या; अस्थिकणिका का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति तीव्रता; और astrocytes का घनत्व (संख्या / 1000 माइक्रोन 2)। इस प्रयोजन के लिए, हम साथ या एक विरोधी भड़काऊ पदार्थ के रूप में genistein इलाज के बिना Aβ 1-40 के इंजेक्शन intrahippocampal के संपर्क में चूहों से मस्तिष्क वर्गों का इस्तेमाल किया। वर्णित प्रोटोकॉल morphometric एक के लिए इस्तेमाल किया जा सकताइन विट्रो में या अलग अलग परिस्थितियों में विवो में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं alysis।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम अस्थिकणिका आकृति विज्ञान के साथ जुड़े थे कि 12 विभिन्न मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए 3 डी कोंफोकल morphometry कार्यरत हैं। इस प्रयोजन के लिए, Aβ 1-40 साथ चूहों के हिप्पोकैम्पस ऊतक <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
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