Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

Summary

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Abstract

Som glialceller i hjernen, astrocytter har forskjellige funksjonelle roller i sentralnervesystemet. I nærvær av skadelige stimuli, astrocytter endre deres funksjonelle og strukturelle egenskaper, en tilstand som kalles reaktiv astrogliosis. Her er en protokoll for vurdering av de morfologiske egenskaper av astrocytter presenteres. Denne protokollen innbefatter kvantifisering av 12 forskjellige parametere dvs. overflatearealet og volumet av vev som dekkes av en astrocytt (astrocytt territorium), hele astrocytt inkludert grener, cellelegemet, og kjernen, samt den totale lengde og antall grener, intensiteten av fluorescens immunreaktiviteten av antistoffer som brukes for astrocytt deteksjon, og astrocytt tetthet (antall / 1000 mikrometer ^2). For dette formål er tre-dimensjonale (3D) konfokale mikroskopiske bilder ble laget, og 3D-bildeanalyse-programvare som Volocity 6,3 ble brukt for målinger. Rottehjernevevet eksponeres for amyloid beta _1-40 </sub> (Ap _1-40) med eller uten en terapeutisk intervensjon ble anvendt for å presentere metoden. Denne protokollen kan også benyttes for 3D morfometrisk analyse av andre celler fra enten in vivo eller in vitro betingelser.

Introduction

Hos friske sentralnervesystemet (CNS), astrocytter spiller en viktig rolle i reguleringen av blodstrøm, energimetabolisme, synaptisk funksjon og plastisitet, og ekstracellulær ion og nevrotransmitter homeostase ^1-3. I tillegg, astrocytter svare på forskjellige skadelige stimuli og unormale tilstander som traumer, infeksjoner, ischemi eller nevrodegenerasjon via reaktive astrogliosis som er karakterisert ved hypertrofi, proliferasjon og funksjonell ombygging av astrocytter ^4,5.

Reaktiv astrogliosis kan ingeniør den inflammatoriske respons og reparasjonsprosessen i vev og kan derfor påvirke det kliniske resultatet av terapeutiske intervensjoner. Følgelig har astrocytter fått oppmerksomhet fra hjerneforsker i løpet av de siste tiårene som potensielle mål for terapi for en rekke sykdommer som påvirker sentralnervesystemet.

Astrocytter har normalt en stel form med godt defined grener som sprer rundt soma ^6. I en sykelig tilstand i hjernen, astrocyttkulturer grener blitt korrugert og viser hoven ender ^7, for eksempel i nærvær av amyloid-beta (Ap).

Denne artikkelen presenterer en protokoll for å analysere 3D-bilder av astrocytter kjøpt av konfokalmikroskopi. Tolv ulike kvantitative parametre for hver astrocyte ble målt: de flater og volumer av astrocyte territorium (vevet dekket av en astrocyte), hele cellen (herunder filialer), cellekroppen, og kjernen; den totale lengden og antallet grener; fluorescensintensiteten av antistoffer som brukes for astrocytt deteksjon; og tettheten av astrocytter (antall / 1000 mikrometer ^2). For dette formål, har vi brukt hjerneseksjoner fra rotter eksponert for intrahippocampal injeksjon av Ap _1-40 med eller uten genistein behandling som et anti-inflammatorisk substans. Den beskrevne protokoll kan benyttes for et morfometriskalysis av ulike celletyper in vitro eller in vivo i forskjellige forhold.

Protocol

Denne studien ble utført i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH) er godkjent av Ethic Committee of Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran). 1. Dyr, kirurgi og Prøve Forberedelser MERK: Forbered hjernevev for 3D confocal mikroskopisk analyse. Fordel dyr tilfeldig i to grupper: Ap 1-40 -injection (n = 8), og Ap 1-40 -injection med genistein behandling (n = 8); adm…

Representative Results

Denne delen presenterer noen eksempler på kvalitative og kvantitative observasjoner produsert av 3D morfometrisk analyse. For fullstendige resultater fra alle 12 parametere som er nevnt tidligere, vennligst se vår forrige publisering 10. Kvalitative Observasjoner Astrocytter utstilt tynne eller tykke greiner som var vanligvis lenge i Ap 1-40 injisert rotter (Figur 1). Noen små stelformede astrocytter med korte grener ble …

Discussion

I dagens protokoll, benyttet vi 3D konfokal morfometri å vurdere 12 ulike parametere som var knyttet til astrocyte morfologi. For dette formål hippokampalt vev fra rotter med Ap _{1-40 –} ble indusert astrogliosis, med eller uten forbehandling genistein som et anti-inflammatorisk middel som anvendes. Ved å bruke 3D-bilder og morfometrisk programvare, var vi i stand til å vise effekten av genistein på astrogliosis dvs. morfologi astrocytter.

Endringer i den intra- og eks…

Materials

Amyloid beta 1-40	Sigma Aldrich	79793	Keep in -70 °C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	keep in -20 °C
polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein	DAKO	Z0334
alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies	DAKO
Liquid Permanent Chromogen	DAKO	K0640
Liquid permanent Red Substrate Buffer	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Polyethoxylated castor oil – Step 1.1
LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Image Analysis 2000	Tekno Optic
Streotaxic apparatus	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.