सिंगल सेल स्राव के spatio- लौकिक इमेजिंग के लिए एक लेबल मुक्त तकनीक

Summary

इंटर सेलुलर संचार के भीतर और सेल के बाहर विभिन्न शारीरिक गतिविधियों को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पत्र एकल कक्ष स्राव के spatio- लौकिक प्रकृति को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एक दृष्टिकोण जीना सेल इमेजिंग के साथ संवेदन लेबल मुक्त nanoplasmonic जो एकीकृत प्रयोग किया जाता है।

Abstract

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.

In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.

A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Introduction

इंटर सेलुलर संचार के अंदर और सेल के बाहर दोनों कई शारीरिक गतिविधियों के नियमन के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन और पुटिकाओं की एक किस्म बाद में इस तरह के भेदभाव, घाव भरने, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, प्रवास, और प्रसार के रूप में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं है कि ट्रिगर स्रावित जा सकता है। अंतर-सेलुलर संकेत रास्ते में से ^1-5 खराबी कैंसर, atherosclerosis सहित कई विकारों में फंसाया गया है और मधुमेह, कुछ नाम हैं।

इष्टतम सेल स्राव परख spatially और अस्थायी प्रासंगिक संकेत दे रास्ते में बाधा पहुँचा के बिना ब्याज के स्रावी प्रोटीन मानचित्रण के लिए सक्षम होना चाहिए। इस रास्ते में एकाग्रता प्रोफाइल और प्राप्त कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के बीच अनौपचारिक सम्बन्ध अनुमान लगाया जा सकता है। दुर्भाग्य से, सबसे अधिक इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट आधारित तकनीक के कई इन मानदंडों को पूरा नहीं करते। फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन डब्ल्यू विश्लेष्य टैग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासेल Ithin लेकिन स्रावी मार्ग को बाधित कर सकते हैं, या स्रावित करता है, तो, अंदाजा लगाना मुश्किल है जो सेल के बाहर एक फैलाना चमक में परिणाम है। फ्लोरोसेंट immunosandwich आधारित assays सेलुलर स्राव का पता लगाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों हैं, लेकिन आम तौर पर व्यक्ति की कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, संवेदन एंटीबॉडी की शुरूआत आम तौर पर रुकती है या प्रयोग और एंटीबॉडी लेबल के आकार समाप्त होता है ^6-11, 150 केडीए आईजीजी के लिए, बहाव के संकेत के लिए एक बाधा है।

इन बाधाओं का यह एक लेबल मुक्त तकनीक, छवि प्रोटीन स्राव करने और मौजूदा लेबल मुक्त प्रौद्योगिकियों के बीच उपयोग किया plasmon अनुनाद (एसपीआर) सतह और स्थानीय सतह plasmon अनुनाद (LSPR) सेंसर उत्कृष्ट उम्मीदवार हैं हो कि बेहतर है क्योंकि। ^12-17 इन सेंसर व्यापक रूप से प्रोटीन, exosomes और अन्य बायोमार्कर की विश्लेष्य बाध्यकारी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। ^18-24 LSPR, plasmonic nanostr के मामले मेंuctures कांच coverslips पर पत्थर के छापे से छापने से नमूनों और मानक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी विन्यास के माध्यम से दृश्य प्रकाश का उपयोग कर उत्साहित किया जा सकता। कारण उनके nanoscale के पदचिह्न के लिए, कांच के अध के बहुमत ^25-28। ऐसे रहते सेल माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकरण के लिए अनुकूल उज्ज्वल क्षेत्र और अच्छी तरह से इन जांच कर रही है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में आम इमेजिंग तकनीक के लिए उपलब्ध है हम वास्तविक समय माप का प्रदर्शन किया है क्रमश: 225 मिसे और 10 माइक्रोन के स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ क्रियाशील सोने plasmonic nanostructures का उपयोग कर हाइब्रिडोमा कोशिकाओं से एंटीबॉडी स्राव की। बुनियादी चिप विन्यास चित्रा 1 में सचित्र है। ²⁸ माइक्रोस्कोप के उत्पादन में प्रकाश पथ चित्रण के लिए इस्तेमाल एक सीसीडी कैमरा और nanostructures की दी गई सरणी का आंशिक अधिभोग (चित्रा 2 की मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक फाइबर ऑप्टिकली युग्मित स्पेक्ट्रोमीटर के बीच विभाजित है )।

protocएक साथ मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की निगरानी करते हुए इस पत्र में प्रस्तुत राजभाषा एकल कक्ष स्राव का वास्तविक समय माप के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का वर्णन है। इन दोनों क्षेत्रों की दृष्टिकोण सेल लाइनों की nanostructures की निर्माण, analytes की बाध्यकारी उच्च आत्मीयता के लिए nanostructures की functionalization, दोनों गैर विशिष्ट बंधन को कम करने और एक वाणिज्यिक सतह plasmon अनुनाद का उपयोग कर गतिज दर स्थिरांक निस्र्पक (एसपीआर) उपकरण के लिए सतह अनुकूलन, एकीकरण भी शामिल सब्सट्रेट, और कल्पना और वर्णक्रम आंकड़ों के विश्लेषण पर। हम सेल स्राव और प्राप्त कोशिकाओं के साथ उनके कारण रिश्तों की spatio- लौकिक मानचित्रण के लिए एक सक्षम प्रौद्योगिकी होने के लिए इस तकनीक की आशा।

Protocol

1. Nanostructure निर्माण नैनो के लिए substrates के रूप में 170 माइक्रोन (संख्या 1.5) की एक अनुमानित मोटाई के साथ 25 मिमी व्यास कांच coverslips चुनें। कम से कम 6 घंटे के लिए: (सल्फ्यूरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 1 के अनुपात 3) पिरान्हा समाधान में coverslips विसर्जित कर दिया। Ultrapure 18.2 MΩ विआयनीकृत आसुत जल (DDW) की प्रचुर मात्रा के साथ पिरान्हा लथपथ coverslip धो लें। चेतावनी: पिरान्हा एसिड कार्बनिक सामग्री के साथ हिंसक प्रतिक्रिया करता है और अत्यधिक सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। ई-बीम वाष्पीकरण द्वारा coverslips पर जमा 10 एनएम क्रोमियम पतली फिल्म nanostructures की patterning और इमेजिंग के दौरान प्रभारी प्रभाव से बचने के लिए। बाईलेयर की पहली परत 45 सेकंड के लिए 2000 rpm पर एथिल लैक्टेट मिथाइल methacrylate (MMA_EL6) copolymer से मिलकर विरोध स्पिन और फिर 150 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना। तो 180 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना 45 सेकंड के लिए 3000 rpm पर पाली मिथाइल methacrylate (950PMMA_A2) की दूसरी परत स्पिन। गपशपएन बाईलेयर 300 μC / 2 सेमी की एक क्षेत्र को खुराक के साथ 25 केवी पर इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी (EBL) का उपयोग कर विरोध। Isopropyl शराब में विकास करना (आईपीए) / मिथाइल isobutyl कीटोन (MIBK): 2/1 और आईपीए में कुल्ला। जमा तिवारी (5) एनएम एक ई-बीम बाष्पीकरण का उपयोग कर सब्सट्रेट पर / एयू (80 एनएम) फिल्म। सोने के बयान के बाद, copolymer बाईलेयर 4 घंटे के लिए एसीटोन में सब्सट्रेट भिगोने से विरोध लिफ्ट बंद। Nanostructure आकृति और आकार पुष्टि करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का उपयोग कर सब्सट्रेट का निरीक्षण किया, आरटी पर 60 सेकंड के लिए CR-7 एचेंट का उपयोग कर गीला खोदना के माध्यम से सब्सट्रेट से शेष क्रोमियम को हटाने और फिर DDW में कुल्ला। सरणियों के बीच सेल इमेजिंग के लिए जगह छोड़ने के लिए 33 माइक्रोन का एक केंद्र के लिए केंद्र सरणी रिक्ति डिजाइन। पैटर्न एक ई-किरण लेखक का उपयोग कर 300 एनएम की पिच के साथ प्रत्येक सरणी के लिए 20 x 20 पैटर्न में nanostructures। प्रत्येक चिप 80 ± 2.5 एनएम ऊंचाई का एक विशिष्ट nanostructure आयाम के साथ 300 सरणियों और 70 ± 2.5 एनएम diame शामिलआतंकवाद। आकार और एकरूपता के सत्यापन के लिए परमाणु शक्ति सूक्ष्मदर्शी (AFM) का उपयोग सरणियों के एक सबसेट का निरीक्षण किया। एक यूवी इलाज epoxy का उपयोग coverslip के पीछे करने के लिए एक समर्थन अंगूठी, आमतौर पर सिलिकॉन संलग्न। 2. चिप सफाई और आत्म इकट्ठे monolayer के आवेदन 5% हाइड्रोजन, एक ही परिस्थितियों में 5 मिनट के लिए चैम्बर की सफाई के बाद 45 सेकंड के लिए 95% आर्गन की एक 300 mTorr मिश्रण में 40 डब्ल्यू के एक शक्ति पर सफाई और चिप्स regenerating, प्लाज्मा ऐश के लिए। एक 3 से मिलकर एक दो घटक ethanolic thiol समाधान में चिप डुबो कर तुरंत प्लाज्मा ashing के बाद सोने nanostructures functionalize: (सीएच 2) SH- की 1 के अनुपात 8 -EG 3 ओह (एसपीओ) और या तो एक amine के साथ एक घटक या कार्बाक्सिल कार्यात्मक समूह, अर्थात्, SH- (सीएच 2) 11 -EG 3 राष्ट्रीय राजमार्ग 2 (SPN) या SH- (सीएच 2) 11 -EG 3 -COOH (एसपीसी)। चिप मैं छोड़ दोएन thiol समाधान हे / एन एक आत्म इकट्ठे monolayer (एसएएम) के रूप में। नाइट्रोजन गैस के साथ इथेनॉल और सूखे के साथ चिप कुल्ला। यदि आवश्यक हो, 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए क्रियाशील चिप की दुकान। उपयोग के लिए तैयार पसंद का ligand के आधार पर एक रसायन विज्ञान का उपयोग ligand के साथ एसपीएन या छठे वेतन आयोग घटक प्रतिक्रिया करते हैं (देखें नीचे)। नोट: चिप्स पुनर्जीवित और समय की फिर से क्रियाशील दर्जनों जा सकता है। एक दिया चिप 6 महीने से एक वर्ष से अधिक के लिए सीमा है कि अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक दिया सरणी पर मापा स्पेक्ट्रा मज़बूती biofunctionalization द्वारा पीछा प्लाज्मा ashing द्वारा बार-बार regenerations, के बाद प्रतिलिपि हैं। 29 3. सतह functionalization और काइनेटिक विशेषता नोट: ligand और विश्लेष्य के बीच गतिज दर स्थिरांक को चिह्नित करने के लिए वाणिज्यिक एसपीआर साधन में क्रियाशील चिप का उपयोग, साथ ही गैर विशिष्ट बी करने के लिए सैम के प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिएinding। कुशल सतह functionalization के लिए अनुमति देते हैं कि प्रवाह दरों और microfluidic डिजाइन की एक विस्तृत श्रृंखला है। हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसपीआर है के बाद से हम अपनी सिफारिश प्रवाह दरों के आसपास मानकीकृत। हम इन प्रवाह दरों सभी एसपीआर उपकरणों के प्रतीक हैं और बहुत सीमित नहीं हैं कि ध्यान दें। सभी functionalization LSPR चिप पर सीधे किया जा सकता है, लेकिन यह एक मल्टिप्लेक्स साधन है क्योंकि हमारे LSPR microfluidic सेटअप नहीं है, जबकि यह हमारे काम के बोझ को कम किया है क्योंकि इस एसपीआर साधन एक आवश्यकता नहीं है। धारा 2 में वर्णित के रूप में सैम के साथ एक वाणिज्यिक नंगे सोने चिप functionalize। 133 1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide मिमी (ईडीसी) और 33 DDW में एन -hydroxysuccinimide मिमी (एनएचएस) के लिए 10 में से 1 मिश्रण: एक छठे वेतन आयोग के आधार सैम का उपयोग करते हैं, एक 1 के साथ carboxyl समूह सक्रिय मि। 30 μl / मिनट के प्रवाह की दर का उपयोग कर 300 सेकंड के लिए ब्याज की एंटीबॉडी / ligand के साथ सक्रिय carboxyl समूह संयुग्म। में ligands तैयारपीएच 6 फॉस्फेट बफर, आम तौर पर है, लेकिन इस अणु के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। Ligand के विकार के बाद, 30 μl / मिनट की दर से 300 सेकंड के लिए एक Deactivator कदम के रूप में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 0.1 एम ethanolamine प्रवाह। Ethanolamine गैर विशिष्ट बंधन को कम करने में मदद करता है। सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग कर 100 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर ब्याज की विश्लेष्य शुरू करने और एक गतिज विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग गतिज दर स्थिरांक की गणना। गैर विशिष्ट बंधनकारी समस्याग्रस्त है, तो छठे वेतन आयोग या एसपीएन को एसपीओ के अनुपात में वृद्धि। 4. LSPR सामान्य सेटिंग्स माइक्रोस्कोप सेटिंग्स: नमूना रोशन कोहलर के लिए एक 100 डब्ल्यू हैलोजन लैंप का प्रयोग करें। प्रतिध्वनि पारी (चित्रा 2) में योगदान नहीं है कि तरंग दैर्ध्य को समाप्त करने के लिए प्रकाश पथ में एक लंबा पास फिल्टर (आमतौर पर 593 एनएम कटऑफ) का प्रयोग करें। LSPRi डेटा संग्रह के लिए, एक 40x तेल immersio के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोगएन उद्देश्य (1.4 एनए) और एक thermoelectrically 16 बिट सीसीडी कैमरा ठंडा। एक साथ कल्पना और स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप के उत्पादन में बंदरगाह पर एक बीम फाड़नेवाला रखें। 37 को तापमान नियंत्रित माइक्रोस्कोप मंच तैयार सी ° और 4 घंटे के लिए संतुलित करना। क्रमश: 5% और 95% सीओ 2 एकाग्रता और नमी को विनियमित करने के लिए माइक्रोस्कोप पर एक अतिरिक्त ऊष्मायन विधानसभा को शामिल। चिप तैयार करने और बढ़ते: एसपीआर प्रयोगों से निर्धारित इष्टतम दो घटक सैम अनुपात के साथ धारा 2 में वर्णित के रूप में LSPR चिप functionalize। इस प्रकार के रूप में एक कस्टम बनाया microfluidic धारक के भीतर चिप लोड करें। एक एल्यूमीनियम नीचे टुकड़ा पर चिप रखें। यह नीचे टुकड़ा और एक सिलिकॉन गैसकेट और एक स्पष्ट प्लास्टिक शीर्ष टुकड़ा के बीच चिप सैंडविच। विधानसभा शिकंजा कसने के लिए 4 शिकंजा प्रयोग करें। 1 मिक्स: एक ठेठ छठे वेतन आयोग के आधार पर thiol आवेदन के लिए, एक 1 μl कोट 300 ड्रॉपईडीसी 133 मिमी और DDW में एन एच एस के 33 मिमी की संरचना छठे वेतन आयोग thiol घटक की carboxyl समूहों को सक्रिय करें। 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और मैन्युअल 10 मिमी पीबीएस के साथ सतह कुल्ला। Ligand के समाधान के 300 μl कोटिंग ड्रॉप द्वारा ब्याज की ligand (आमतौर पर एक एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़ा) के साथ सक्रिय carboxyl समूह संयुग्म। 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और मैन्युअल 10 मिमी पीबीएस के साथ कुल्ला। अविशिष्ट बाध्यकारी कम करने के लिए चिप पर कोट पीबीएस में 0.1 एम ethanolamine के 300 μl गिरा। 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। पीबीएस 0.005% बीच 20 (पीबीएस टी -20) युक्त साथ ethanolamine धो लें। एक बदलते meniscus से संबंधित आंकड़ों में उतार चढ़ाव को कम करने के लिए चिप के ऊपर एक क्वार्ट्ज टुकड़ा रखें। माइक्रोस्कोप पर बढ़ते जबकि पीबीएस टी -20 बफर के साथ गीला चिप रखें। गर्म मंच नमूना धारक में मजबूती से LSPR चिप विधानसभा की जगह और microfluidic ट्यूबिंग देते हैं। विधानसभा और प्रवाह बू microfluidics टयूबिंग संलग्नffer (या सेल के अध्ययन के लिए सीरम मुक्त मीडिया) एक स्थिर अवस्था तक पहुँच जाता है। विधानसभा और माइक्रोस्कोप के कम से कम 2 घंटे के लिए संतुलित करने की अनुमति दें। केंद्रीय सरणी स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए फाइबर ऑप्टिक के साथ गठबंधन किया है कि इतने जॉयस्टिक का उपयोग कर चिप संरेखित करें। स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा एक स्पेक्ट्रोमीटर और वर्णक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लिया जाता है। सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस, जीस निश्चित ध्यान केंद्रित या समकक्ष ऑटोफोकस डिवाइस का उपयोग करके प्रयोग के दौरान ध्यान में सरणियों रखें। 9E10 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं से एंटी-C-MYC स्राव के 5. LSPR इमेजिंग नोट: इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल हाइब्रिडोमा सेल लाइन एक रासायनिक ट्रिगर की आवश्यकता नहीं है अनिवार्यता और इसलिए विरोधी सी Myc एंटीबॉडी का इजहार सी-MYC पेप्टाइड के साथ nanostructures functionalize। इस क्लोन 9E10 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित विरोधी सी Myc एंटीबॉडी के लिए 1.77 एनएम के एक कश्मीर डी का महत्व है। पूर्ण में संस्कृति हाइब्रिडोमा कोशिकाओं5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक T75 फ्लास्क में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% एंटीबायोटिक के साथ ई मध्यम विकास। / एमएल 4 × 10 5 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व को बनाए रखें। सेल स्राव पढ़ाई के लिए, centrifugation द्वारा T75 कुप्पी से गोली कोशिकाओं, स्रावित एंटीबॉडी हटाने और 4 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल सेल घनत्व को समायोजित करने के लिए RPMI 1640 सीरम मुक्त मीडिया (SFM) के साथ दो बार धो लें। LSPR चिप्स के लिए उन पर शुरू करने से पहले व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं और परीक्षण हार्वेस्ट। स्वयं एक micropipette के साथ LSPR चिप्स पर सेल समाधान के 50 μl परिचय दें। कुछ ही मिनटों के बाद 25 से 50 कोशिकाओं LSPR चिप्स की सतह का पालन करें। Microfluidic छिड़काव प्रणाली का उपयोग करते हुए ताजा SFM के साथ समाधान में शेष कोशिकाओं को दूर धो लें। 10 माइक्रोन के भीतर बंद कर रहे हैं, जो इमेजिंग के लिए LSPR सरणियों, का चयन करें, लेकिन कोशिकाओं के साथ ओवरलैपिंग नहीं। संकेत स्रावित विरोधी सी-MYC antib के लिए विशिष्ट है कि यह सुनिश्चित करने के लिएodies साथ और वर्तमान एंटीबॉडी के बिना के रूप में अच्छी तरह से एंटीबॉडी के साथ, लेकिन समाधान में सी-MYC पेप्टाइड का एक saturating एकाग्रता की उपस्थिति से अवरुद्ध उनकी बाध्यकारी साइटों के साथ सेल संस्कृति मीडिया परिचय। विरोधी सी Myc एंटीबॉडी (250 एनएम) के एक saturating समाधान के साथ प्रत्येक चलाने के अंत में सेंसर जांचना। यह प्रत्येक रन के biofunctionalization प्रोफाइल के आधार पर आंशिक अधिभोग सेंसर की प्रतिक्रिया को सामान्य बनाने में मदद करता है और निर्धारित करते हैं। छवि संरेखण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक्स और वाई दिशा में बहाव सही।

Representative Results

एक ठेठ रहते सेल स्राव अध्ययन में जगह लेने के डेटा संग्रह के कई तरीके हैं। 3 वर्ग सरणियों पर प्रकाश डाला गया है, जो एक LSPRi छवि, का ओवरले से पता चलता है, और निचले बाएँ पर सेल पर प्रकाश डाला गया है, जो एक प्रेषित प्रकाश प्रबुद्ध छवि। डाटा आमतौर पर नीचे वर्णित सामान्य बनाने गणना के लिए विश्लेष्य की एक saturating समाधान की शुरूआत के बाद एक तीन घंटे की अवधि में एकत्र किया जाता है। प्रतिदीप्ति कल्पना भी एक फिल्टर क्यूब के स्वचालित स्विचिंग से डेटा संग्रह दिनचर्या में एकीकृत किया जा सकता है। चित्रा 4 फ्लोरोसेंट झिल्ली डाई rhodamine DHPE के साथ दाग एक सेल में lamellipodia-तरह एक्सटेंशन (तीर) दर्शाती है। ऐसे एक्सटेंशन सरणियों के साथ ओवरलैप करने के लिए थे, तो वे प्रोटीन स्राव के लिए एक झूठी सकारात्मक देना होगा। कल्पना के विभिन्न साधनों के बाद इस तरह की घटनाओं की पहचान में मदद कर सकते हैं। चित्रा 5 स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले डेटा और पीछे से पता चलता हैएर एक saturating समाधान की शुरूआत व्यावसायिक रूप से सी-MYC क्रियाशील सरणियों के लिए एंटी-सी Myc एंटीबॉडी खरीदी (400 एनएम)। कोई कोशिकाओं इस प्रयोग में उपस्थित थे। स्पेक्ट्रम एक लाल पारी और तीव्रता में वृद्धि दोनों को प्रदर्शित करता है। दो घटता तहत क्षेत्रों के बीच अंतर सीसीडी कैमरे पर LSPRi मोड में सरणी छवि तीव्रता में वृद्धि का परिणाम है। एक गैर रेखीय कम से कम वर्गों डेटा विश्लेषण दृष्टिकोण स्पेक्ट्रा से सतह बाध्य ligands के आंशिक अधिभोग अनुमान करने के लिए विकसित किया गया है। 30,31 प्रयोग के अंत में, संतृप्त तीव्रता मूल्यों (आंशिक अधिभोग ≈ 1 यानी) निम्न सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक सरणी के लिए एक सामान्यीकृत प्रतिक्रिया की गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: समय बिंदु टी में समय बिंदु टी में सामान्यीकृत तीव्रता, प्रयोग, अंतिम संतृप्त तीव्रता के शुरू में प्रारंभिक तीव्रता, और सरणी के मापा तीव्रता कहाँ हैं </eमीटर>, क्रमशः। दो सरणियों से सामान्यीकृत मूल्यों 6 चित्र में दिखाए जाते हैं। एक सरणी, एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया है, जबकि अन्य जांच के तहत सेल के 10 माइक्रोन के भीतर था सेल से 130 माइक्रोन की दूरी थी। नियंत्रण सरणी के फ्लैट प्रतिक्रिया करने के लिए सेल रिश्तेदार के सबसे करीब सरणी की सामान्यीकृत जवाब में अचानक वृद्धि स्रावित एंटीबॉडी के एक स्थानीय फट का सूचक है। 1. सेंसर डिजाइन चित्रा। एक ठेठ रहते सेल स्राव प्रयोग की ज्यामिति चित्रण। सेल (नीले अंडाकार आकृति) एक ड्राइंग biofunctionalized सोने nanostructures की सरणियों में शामिल है जो LSPR चिप पर जमा किया जाता है। वे सतह के लिए बाध्य के रूप में वाई के आकार के अणुओं के रूप में दिखाया इस मामले एंटीबॉडी में तेजी से बढ़ी-में देखने के लिए, ब्याज की सेल स्राव, में मापा जाता है,क्रियाशील nanostructures की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2. ऑप्टिकल सेटअप। एक हैलोजन लैंप से प्रबुद्ध प्रकाश पहले एक लंबे पास फिल्टर (एलपी) द्वारा फ़िल्टर किया जाता है। प्रकाश रैखिक (P1) के ध्रुवीकरण और एक 40x / 1.4 एनए उद्देश्य के माध्यम से नमूना illuminates है। बिखरे हुए प्रकाश एक पार polarizer (p2) के माध्यम से उद्देश्य से एकत्र की है और पारित कर दिया है। एक 50/50 बीम फाड़नेवाला (बी एस) एक साथ स्पेक्ट्रोस्कोपी और कल्पना के विश्लेषण के लिए एकत्र प्रकाश पथ में डाला जाता है। शीर्ष अधिकार:। 300 एनएम की पिच से अलग 9 व्यक्ति nanostructures की एक परमाणु बल माइक्रोस्कोपी छवि यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए। चित्रा 3. लाइव सेल LSPRi अध्ययन। एक 12 सरणियों से घिरा हुआ एक भी हाइब्रिडोमा सेल (निचले बाएं) दिखा प्रेषित प्रकाश और LSPRi की छवि विलय कर दिया। यह एक विपरीत बढ़ाया छवि है। स्केल बार 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4. लाइव सेल प्रतिदीप्ति अध्ययन। एक झिल्ली डाई है जो rhodamine DHPE, साथ दाग एक भी हाइब्रिडोमा सेल की एक फ्लोरोसेंट झूठी रंग छवि। सरणियों आम तौर पर दिखाई नहीं देते हैं फ्लोरोसेंट इमेजिंग मोड में, हालांकि, पास के एक सरणी एबी के रूप में यहाँ मानने योग्य हैनिचले सही कोने में वर्ग की कमी है। सेल कोशिकाओं (तीर) से बाहर की ओर विस्तार कर रहे हैं मूंछ की तरह एक्सटेंशन (संभवतः filopodia या lamellipodia) हालांकि सरणी से अलग होने के लिए देखा जा सकता है। स्केल बार 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5. स्पेक्ट्रल साधन। पहले और विरोधी सी Myc एंटीबॉडी के 400 एनएम समाधान की शुरूआत के बाद एक सी-MYC क्रियाशील सरणी से प्राप्त स्पेक्ट्रा। कोई कोशिकाओं को इस अध्ययन में उपस्थित थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img alt="चित्रा 6" src= "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg" /> चित्रा 6 सिंगल सेल स्राव। 15 एक एकल कोशिका के माइक्रोन और 130 माइक्रोन दूर स्थित एक (नियंत्रण) के भीतर स्थित एक सरणी की प्रतिक्रिया। स्केल बार 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.^7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.

There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.

The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.³³ Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.

Materials

25mm diameter glass coverslips	Bioscience Tools	CSHP-No1.5-25	170±5 µm is optimal
Poly-methyl methacrylate	Microchem	PMMA 950 A4
Ethyl lactate methyl metacrylate	Microchem	MMA EL6
Electron beam evaporator	Temescal	FC-2000
Electron beam lithography	Raith	Series 150
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Acetone	Sigma-Aldrich	320110
CR-7 chromium etchant	Cyantek	CR-7
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 55
Atomic force microscope	Veeco	Nanoscope III
Plasma ashing system	Technics	Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
Surface plasmon resonance system	Biorad	XPR36
Bare gold chip	Biorad	GLC chip	Plasma ashed to remove the monolayer
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide	Thermo	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo	24510
Pentylamine-Biotin	Thermo	21345
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Neutraavidin	Thermo	31000
Phosphate buffered saline	Thermo	28374
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Inverted microscope	Zeiss	Axio Observer	Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH
CCD camera	Hamamatsu	Orca R2	Thermoelectrically cooled (16 bit)
Spectrometer	Ocean Optics	QE65Pro
Spectrasuite	Ocean Optics	version1.4
c-myc peptide HyNic Tag	Solulink	SP-E003
monoclonal anti-c-myc antibody	Sigma-Aldrich	M4439
Hybridoma cell line	ATCC	CRL-1729
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Serum free media RPMI 1640	Invitrogen	11835-030
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Rhodamine DHPE	Life Technologies	L-1392