Her præsenterer vi en protokol, der er baseret på rygmarv skiver dyrket på multi-elektrodesæt at studere funktionelle regenerering af propriospinal forbindelser in vitro.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Organotypiske skive kulturer af centralnervesystemet (CNS) har været anvendt i vid udstrækning til undersøge forskellige fysiologiske og patologiske fænomener nå fra neuronal udvikling til neurodegeneration. Sammenlignet med dissocierede cellekulturer, organotypiske skiver har den fordel mere kompliceret med en intakt cytoarchitecture og lokalt synaptiske kredsløb. Samtidig kan vævet analyseres i en isoleret måde uden behov for at indblande forviklinger af hele in vivo sammenhæng. Desuden er let og gentagne adgang til cellerne af valg berettiget, det ekstracellulære miljø kan styres præcist og sædvanligvis in vitro modeller er billigere end deres in vivo modstykker. I de senere år forskellige undersøgelser, præsenterede slående ligheder mellem de udviklingsmæssige profiler af langsigtede kulturer versus tilsvarende levende dyr 1,2. Det er blevet vist, at neuronale kredsløb af forskellige CNS regions udtrykker spontan netværk aktivitet under udvikling, og at organotypiske skiver delvist opretholde dette fænomen 3 -7. Isolerede rygmarv forberedelser er især anvendt til at undersøge rytme generation 6 og dannelsen af neuronale kredsløb 1.
En måde at optage den spontane aktivitet af organotypiske skiver er at kulturen dem oven på multi-elektrodesæt (MEA). Disse enheder indeholde flere elektroder, der kan overvåge de ekstracellulære potentialer genereres af aktionspotentialer fra mange celler samtidigt (multi-enhed optagelse). Den høje tidsopløsning af MEA optagelser kan anvendes til at rekonstruere de præcise aktivitet dynamik inden for en given neuronal kredsløb. Derudover er der i modsætning til patch-fastspænding teknikken er non-invasiv, der tillader langsigtede målinger og resultater i, at neuroner ikke påvirkes i deres adfærd.
Feller formålet med denne undersøgelse blev kombinationen af organotypiske rygmarven co-kulturer og multisite optagelser bruges til at undersøge funktionel regenerering inden rygmarven. Da voksne højere hvirveldyr har begrænset potentiale til at komme sig skader på rygmarven, har forskellige strategier blevet undersøgt for at fremme regenerering efter rygmarvsskade. Hidtil har det corticospinal tarmkanalen normalt været model foretrukne system for sådanne undersøgelser. Disse eksperimenter er typisk tidskrævende, dyrt og kræver store dyr kohorter grund af høj variabilitet inden for enkelte grupper. Desuden tyder på, at propriospinal forbindelser (neuroner, der er helt indesluttet i rygmarven) kan spille en central rolle i helbredelsesprocessen efter rygmarvslæsioner 8. Disse fibre er vanskelige at studere in vivo uden indblanding fra stigende og faldende fiber skrifter. Bonnici og Kapfhammer 9 brugte langsgående rygmarvskive kulturer af postnatal mus som en alternativ tilgang. Efter at have udført mekaniske læsioner analyserede de semi-kvantitativt den morfologiske regenerering af axoner mellem rygmarv segmenter. De observerede mindre, men ikke ingen axoner krydser læsionsstedet i kulturer skåret i en moden alder. I modsætning hertil kulturer, der blev læderede i en yngre tidspunkt viste en stor mængde af axonal regenerering 5 – 7 dage efter skaden. Blev dog bevis for funktionelle forbindelser ikke præsenteret.
Derfor kan udviklingen af en repræsentant in vitro model af propriospinal fibre, der tillader undersøgelse af funktionelle regenerering være et værdifuldt redskab til at udvide vores viden om regenerative processer i rygmarven.
Flere elementer i den præsenterede procedure er fundamentale for udførelsen af nøjagtige og reproducerbare eksperimenter. Alle trin under fremstillingen af MEA, opløsninger og fremstillingen af skive kulturer udføres under sterile betingelser i en laminær strømning. Antibiotika anvendes ikke på det næringsstof medie, fordi de kan påvirke den spontane aktivitet 14. Under MEA belægning, den vigtigste del er at sikre, at den ekstracellulære matrix gelopløsning forbliver koldt på alle tidspunkter. Thaw den i køleskabet og holde det på is i hele proceduren for at sikre en maksimal temperatur tæt på 0 ° C. Under forberedelsen af skiver hurtig isolation og sektionering, samt at være opmærksom på en lav temperatur ved hjælp af iskolde dissektion buffere øger andelen af sunde kulturer. Desuden plasma / thrombin koagulation er en af de mest kritiske trin. Først skal du sikre, at plasma er korrekt mixed med thrombin. For det andet, være særlig opmærksom på at fjerne så meget rest som muligt for at sikre en ordentlig fastgørelse af skiverne til multilaterale miljøaftaler. Dette trin er yderst tidsfølsomme; hvis tidsrammen er for kort, for meget af plasma / thrombin blandingen fjernes. Hvis tidsrammen er for lang, koagulation allerede er sket, hvilket øger risikoen for at fjerne skiverne sammen med den resterende plasma / thrombin.
Hvis der er planlagt mekaniske læsioner, er det vigtigt at anvende MEA med et præcist design. Det område, hvor læsionen er bestemt skal være fri for elektroder, ledninger og isolering. Ellers electrics af MEA vil blive beskadiget og derfor kan ingen optagelser udføres længere.
Et andet afgørende skridt vedrører størrelsen af læsionen. Det er blevet vist tidligere, at genskabe to unge skiver efter læsion tager omkring to dage 10. Til alle forsøg blev den tommelfingerregel bruges at rummet between skiverne efter læsion bør ikke være større end bredden af MEA rille (300 um). En større læsionsstørrelsen kan resultere i en længere tidsramme for gentilslutning eller, hvis læsionen er for stor, ikke gentilslutning overhovedet. At anmærke, tidligere eksperimenter viste, at en indledende placering af de to skiver længere væk end 1 mm resulterer i en meget lav tilslutning sats.
Før starten af optagelserne, en justering på mindst 10 min til stuetemperatur, i stedet for 37 ° C i inkubatoren, og til den ekstracellulære opløsning, i stedet for næringsmedium anbefales. Tæt observation af aktivitetsmønster under disse indledende minutter sikrer, at de målte data repræsenterer den bristede mønster af kulturen passende efter optagelsen blev startet.
Til påvisning af aktiviteten, erhvervelse af data og yderligere behandling, hjemmelavet hardware (optagelsen kammer, forbindelser til forstærkere og forstærkere), programmer i LabVIEW, er C ++ og IgorPro brugt. Kommercielle MEA opsætninger og andre software pakker er velegnet som godt for disse operationer. Her bliver signalerne set af elektroderne forstærkes 1001 gange, og derefter digitaliseres ved en hastighed på 6 kHz.
Den præsenterede model kan være et nyttigt redskab til at undersøge propriospinal forbindelser, fordi in vivo, er de vanskelige at studere uden indblanding fra stigende og faldende fiber skrifter. Co-dyrkning af to rygmarv skiver kan elegant omgå dette problem. Kulturerne giver en mikromiljø, der kan styres stramt og let kan manipuleres. På den anden side, supraspinale og sanseindtryk er naturligvis mangler. Derudover fremgangsmåden ifølge fremstilling kultur repræsenterer en situation med CNS-skade. Gliaceller som astrocytter og mikroglia er kendt for at reagere på læsioner med forøget spredning og derfor vævet er til en vis grad reorganiseret. Vedrørende præsenterede tilstandl dannelsen af en glial ar efter udførelse af mekaniske læsioner blev ikke observeret. En forklaring kunne være, at adaptive mekanismer i astrocytter allerede blev udløst under forberedelsen proces, og at læsioner af kulturerne ikke resulterede i en yderligere reaktion. Også, er der ingen beviser for inddragelse af myelin associerede hæmmere, f.eks., Nogo-A, i den lave regenerering potentiale kulturer læderede på en alderdom. Det blev imidlertid vist, at behandling med phosphodiesterase 4-hæmmer Rolipram, startende umiddelbart efter udførelse af læsioner ved 23 DIV øger funktionel regenerering mellem skiverne 10. Disse resultater viser, at genvinding af funktionsevne kan øges i gamle kulturer. Mærkbart, når at tælle antallet af axoner krydser læsionsstedet blev ingen forskel mellem kulturer beskadigede i en ung alder og kulturer beskadigede på en alderdom opdaget. Disse resultater antyder, at mangel på axonal regenerering er ikke den vigtigste årsag feller tab af bedring efter sene læsioner i kultur, og derfor understrege behovet for en model, der giver mulighed for funktionel analyse af regenerering. Synaptic dannelse og synaptisk plasticitet kunne spille en vigtig rolle i helbredelsesprocessen 10. Disse mekanismer fået en masse opmærksomhed i de seneste år, og det er i dag almindeligt accepteret, at de har en stor indflydelse på resultatet, efter rygmarvsskader. Derfor kan en model, der giver stabile forhold at undersøge disse processer i isolation og i stor detalje sikkert bidrage til at opnå indsigt om funktionel regenerering i rygmarven.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |