تلعب الميتوكوندريا أدوارا مركزية في تنظيم التمثيل الغذائي والتوازن. قد يكون من الصعب اكتشاف التغيرات الطفيفة في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا التي تؤثر على فسيولوجيا الكائن الحي في دراسات التمثيل الغذائي للكائن الحي بأكمله. نصف هنا طريقة عزل تعزز الكشف عن التحولات الأيضية الدقيقة في ذبابة الفاكهة السوداء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نظرا لأن الميتوكوندريا تلعب أدوارا في استقلاب الأحماض الأمينية واستقلاب الكربوهيدرات وأكسدة الأحماض الدهنية ، فإن العيوب في وظيفة الميتوكوندريا غالبا ما تضر بحياة أولئك الذين يعانون من هذه الأمراض المعقدة. يعد الكشف عن التغيرات الأيضية في الميتوكوندريا أمرا حيويا لفهم اضطرابات الميتوكوندريا واستجابات الميتوكوندريا للعوامل الدوائية. على الرغم من أن التمثيل الغذائي للميتوكوندريا هو جوهر تنظيم التمثيل الغذائي ، إلا أن اكتشاف التغيرات الطفيفة في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا قد يعوقه التمثيل المفرط للمستقلبات العصارية الخلوية الأخرى التي تم الحصول عليها باستخدام الكائن الحي الكامل أو استخراج الأنسجة الكاملة.
هنا نصف طريقة عزل اكتشفت التغيرات الأيضية الواضحة للميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة التي كانت متميزة بين الذبابة الكاملة والمستحضرات المخصبة بالميتوكوندريا. لتوضيح حساسية هذه الطريقة ، استخدمنا مجموعة من ذبابة الفاكهة التي تؤوي الحمض النووي للميتوكوندريا المتنوعة وراثيا (mtDNA) وعرضناها لعقار الراباميسين. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا أن الرابامايسين يعدل عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا بطريقة تعتمد على النمط الجيني للميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن هذه التغييرات أكثر تميزا في دراسات التمثيل الغذائي عندما تم استخراج المستقلبات من الكسور المخصبة بالميتوكوندريا. في المقابل ، اكتشفت مستخلصات الأنسجة الكاملة فقط التغيرات الأيضية بوساطة عقار الرابامايسين بشكل مستقل عن mtDNAs.
المقدمة
الهدف من هذا الإجراء هو تطوير الكسور الميتوكوندريا المخصب التي تحقق ما يكفي من نواتج الأيض الميتوكوندريا لالايض الدراسات باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن. في تجربتنا، والايض التحليل باستخدام أساليب الاستخراج الخلوية كلها غير قادرة على اكتشاف التغيرات الطفيفة الأيض الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، تجزئة الميتوكوندريا قبل التحليل الايض يزيد من حساسية لتحديد التحولات الأيض الميتوكوندريا.
الميتوكوندريا هي العضيات الخلوية مسؤولة عن توفير 90٪ من الطاقة التي الخلايا بحاجة لوظيفة عادية 1. في السنوات الأخيرة تم الاعتراف بأن المي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الكواشف وحلول
- إعداد الطعام ذبابة وسائل الإعلام
- حرارة المكونات الذبابة 11٪ سكر، 2٪ الخميرة autolyzed، 5.2٪ دقيق الذرة، أجار 0.79٪ ث / ت في الماء في موقد وضعت في 90 ° C. اثارة بانتظام حتى يتم الحصول على خليط متجانس كثيف قليلا. إعداد الحجم النهائي من 550 مل من ذبابة الغذائية لما مجموعه 100 قارورة مع 5 مل يطير الطعام في كل منهما.
- إزالة من مصدر التدفئة، وإثارة أحيانا حتى الطعام يبرد إلى 80 درجة مئوية وإض....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عن طريق شرح بروتوكول أعلاه، أجرينا تحليل metabolomic على الكسور المخصب الميتوكوندريا ومقتطفات الحيوانية كلها لاختبار تأثير المخدرات rapamycin على mtDNAs المتباينة 7. لقد نجينا 200 ميكرومتر من rapamycin عن طريق إذابة الدواء في الغذاء الطاير. تعرضت الذباب إلى rapamycin لمدة 10 يوما. وقد تم الحصول على نواتج من مقتطفات ذبابة كاملة ومقتطفات من الميتوكوندريا باستخدام اللوني للغاز مطياف الكتلة (GC / MS) والسائل اللوني، جنبا إلى جنب قياس ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي: 1) تربية كافية الذباب في الفضاء وفيرة. من المهم جدا أن لا overpopulate الأقفاص الديموغرافيا مع أكثر من 150 الذباب لكل منهما؛ 2) تغيير الغذائي للأقفاص في كثير من الأحيان لتجنب المنافسة المواد الغذائية والنقص الغذائي. و3) الحفاظ على جميع العينات عند 4 درجة مئوية لضمان سلامة خلال عزل جزء الميتوكوندريا. ويوصى أيضا أن يبرد عازلة العزلة، وغسل العازلة، والزجاج تفلون dounce الخالط قبل الاستخدام. للحد من التلوث عصاري خلوي من الفصائل الميتوكوندريا .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة تطوير أعضاء هيئة التدريس بجامعة Adelphi ومنحة R15GM113156 من NIGMS الممنوحة إلى EVC ، ومنح R01GM067862 من NIGMS ومنح R01AG027849 من NIA الممنوحة إلى DMR.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.2٪ تيجوسيبت-ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات | VWR | AAA14289 | |
| الإيثانول | سيجما ألدريتش | 792799 | |
| مانيتول | سيجما ألدريتش | M4125 | |
| السكروز | سيجما ألدريتش | S9378 | |
| 3- (N< / em>-morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS) | سيجما ألدريتش | M1254 & nbsp ؛ | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | سيجما ألدريتش | 38057 ؛ | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | سيجما ألدريتش | 5470 | |
| KCl | سيجما ألدريتش | P9333 | |
| تريس هيدروكلوريك | سيل سيجما ألدريتش | RES3098T-B7 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2< / sub> منصات لتخدير الذباب | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 لتر قفص | متجر مطعم ويب | 999RD32 | |
| 1 لتر غطاء قفص | مطعم | ويب 999LRD | |
| الخالط الزجاجي التفلون | NC9661231 | العلمي | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S8045 | |
| رابامايسين | مختبرات LC | R-5000 | |
| المضاد للبورين | MitoSciences | MSA03 | |
| مضاد لألفا توبولين | الدراسات التنموية بنك الورم الهجين | 12G10 | |
| بيرس BCA فحص البروتين كيت | ثرمو علمية | 23225 | |
| CO2< / sub> pad | Tritech Research، Inc | قارورة مرشح MINJ-DROS-FP | |
| ENASCO | SB08184M | ||
| سدادة مطاطية | Enasco | S08512M |
المراجع
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
