이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
단백질 – 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 생물학 1 기본적인 단단히 많은 시간과 길이 스케일에서 시공간 메커니즘을 통해 조절된다. 세포막 시그널링 세포에 관한 연구는 예를 들어, 특정 프로톤 펌프 억제제 및 세포 과정 (2)을 용이하게 동적 나노 스케일 공간 구획을 밝혀냈다. 따라서, 충분한 공간 및 시간 해상도, 높은 특이성 및 고감도 생물학적 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 검사 할 수있는 능력은 생물의 기계적 이해를 달성하기위한 키이다.
5 – 이분자 형광 보완 (BiFC)는 세포 내 해상도와 라이브 셀 호환성 3 셀에 프로톤 펌프 억제제를 시각화에 대한 몇 가지 기존 도구 중 하나입니다. 이 기술은 비교적 간단하고 두 비 형광 조각으로 형광 단백질의 분리를 포함한다; 유전자 두 개의 상호 작용하는 단백질에 태그 때근접하게, 단편은 형광 신호를 산출 완전한 형광 단백질을 형성하도록 재구성 할 수있다. 적절하게 설계하면 BiFC 프로브 자발적 프로톤 펌프 억제제의 부재하에 재구성 안된다. 이와 같이, BiFC 분석에서의 형광 신호 만 높은 특이성 프로톤 펌프 억제제의 직접적인 시각화를 가능하게 프로톤 펌프 억제제의 존재하에 일어난다. 판독으로 형광을 사용하는 추가 혜택은 다른 사람의 사이에서 높은 처리량과 높은 콘텐츠 심사 분석, 높은 감도, 세포 내 해상도 및 호환성이다. 이러한 장점에 대해, 다른 상위 형광 단백질에 기초 BiFC 프로브의 수는 개발되었다. 통상적 인 광 현미경 검사에 기초하여 모든 다른 검출 기술에서와 같이, 그러나 BiFC의 공간 분해능은 빛의 회절에 의해 ~ 250 나노 미터로 제한된다. 이 지질 뗏목 (6)을하여 이전 언급과 예시 된 바와 같이, 나노 스케일에서 프로톤 펌프 억제제의 조절을 연구하기 위해 그것에게 도전한다ND 라스 나노 클러스터 (7)는 이러한 시그널링 많은 세포 과정을 이해하는데 중요한 길이 스케일이다.
BiFC는 프로톤 펌프 억제제 (10) 이미징을위한 공간 해상도에서이 한계를 극복하기 위해 광 활성화 현지화 현미경 (PALM) 8,9과 결합되었다. 손바닥 확률 활성화 및 단일 형광 분자의 subdiffractive 현지화를 통해 형광 이미징의 회절 한계를 우회 최근 수퍼 해상력 현미경 기술이다. 각 사이클에서 활성화, 형광 분자는 몇천 광자 몇백을 방출하고 검출기상의 단일 분자 영상을 발생시킨다. 화상 회절 한정 동안 (~ 250 nm의 폭)은, 그 중심은 일반적으로 검출 된 광자의 수에 따라 10 ~ 50 nm 인 주문에, 훨씬 더 높은 정밀도로 측정 할 수있다. 활성화하고 샘플의 각 형광 분자를 로컬 화하여, 고해상도 화상이 재구성 될 수있다. Performe살아있는 세포에 D, 하나의 셀 (11)에서 단백질 확산 궤적 수천의 단일 분자 추적 (SMT를 구분) 종려 추가 허가 취득. 중요한 것은, 손바닥 확률 활성화를 달성하기 위해 이러한 광활성 형광 단백질 (PA-FPS)와 같은 특수 형광 프로브를 사용합니다. BiFC 및 PALM 이용 형광 단백질 양 때문에,이 아미노산 159과 160 사이의 두 단편으로, PALM PAmCherry1 위해, 일반적으로 사용되는 PA-FP를 분할하여 혼합 하였다.
스플릿 PAmCherry1에 기초 BiFC 시스템은 두 조각의 자발적인 재구성에서 낮은 배경 신호를 나타낸다. 상호 작용하는 단백질의 유전자 쌍 태그 때, 두 조각 (RN = 159은 잔기 RC = + 잔기 1백60부터 2백36까지 메트)에도 37 ℃ 낮은 온도에서 배양없이 완전한 PAmCherry1 단백질을 형성하도록 효율적으로 재구성 어느 이러한 부모 mCherry (13)와 같은 다른 BiFC 쌍 (12)의 경우에는 해당되지 않습니다. Furthermo다시 재구성 PAmCherry1 단백질은 정확한 단일 분자 현지화 및 고해상도 PALM 영상에 중요한 다른 사람 사이의 높은 명암비, 매체 광자 수율, 빠른 photoactivation, 같은 부모 PAmCherry1의 광 물리 특성을 유지했다.
이 프로토콜에서, 스플릿 PAmCherry1 (도 1A)를 사용하여 U2OS 세포에서 라스 – 미친 상호 작용을 이미징 BiFC-PALM의 사용을 설명한다. 첫 번째 단계는 PAmCherry1 단편 (즉, RN과 RC) 및 관심 단백질 사이의 융합 단백질을 표현하기위한 구조를 설계하는 것이다. 이론적으로, 후보 단백질 (A 및 B)의 각 쌍에 대해, 융합 단백질 여덟 쌍 테스트 될있다 : RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; -RC / RN-B; 및-RC는 / B-RN. 이 프로세스는 종종 계정에 후보 단백질의 구조적 또는 생화학 적 특성을 고려함으로써 단순화 될 수있다. 라스의 경우, 상기 단백질은번역 후 C- 말단 CAAX 상자에서 수정 (C = Cys이고; = 지방족, X = 모든), 그 후 AAX 모티브 전원이 절단된다. 따라서, RN 또는 RC은 라스의 N 말단에 융합 될 수있다; 이 4 개의 (도 1b)에 대한 융합 단백질의 쌍의 수를 감소시킨다. Raf를 들어, 도메인은 라스 – 결합 (RBD를 잔기 51에서 1백31까지)가 사용되며, 양단에 태그 될 수있다. 이러한 네 융합 구성이 생성되었다 : RN-KRAS / RC-Raf를 RBD; RN-KRAS / Raf를 RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf를 RBD; 와 RC-KRAS / Raf를 RBD-RN.
또한, 단편 및 관심 단백질 사이의 링커는 고려 될 필요가있을 것이다. 약 10 아미노산 링커는 유연 종종 보완이 발생하기에 충분한 자유도를 제공로서 사용된다. 여러 복제 사이트 (MCS) (14)에서 생성 된 임의의 시퀀스를 포함하여 성공적으로 적용되어 많은 사람들이 있기는하지만 그 중 하나 링커, (GGGGS) X2입니다. 링커의 길이는 dependin 최적화 될 필요가있다관심의 단백질과 방향 상호 작용의 크기에 들어.
PAmCherry1 단편의 MCS의 측면에있는 작은 복제 백본에 포함되어 있습니다 (자료 목록 참조). 관심있는 유전자는 제한 부위로 결찰 또는 독립적 인 방식으로 삽입 될 수있다. 클로닝 및 서열 확인 후, 발현 카세트가 재조합 효소 반응, 높은 정확도 및 높은 효율로 복제 프로세스를 사용하여 발현 벡터로 전달된다.
이어서, 생성 된 작 제물은 발현 표적 세포주를 감염위한 안정된 세포주 원하면, 렌티 바이러스로 패키지, 표적 세포주로 형질 감염 또는된다. 과도 형질은 BiFC 구성의 빠른 확인이 가능하지만, 잠재적 인 문제는 주목해야합니다. 종종 화학 물질을 사용하는 형질 감염이 높은 형광도의 결과, 세포를 강조; 반면 전반사 형광 (TIRF) microsco 사용PY는 프로톤 펌프 억제제는 세포막에 일어날 때 조명 볼륨 TIRF 이상적 제한함으로써 이러한 배경 신호를 완화 할 수있다. 또한, 일시적인 형질은 종종까지 프로톤 펌프 억제제를 검출하는 아티팩트가 발생할 수 있습니다 내인성 단백질의 사람들을 초과, 단백질 발현의 높은 수준을 초래할. 따라서, 적절한 BiFC 구성은 초기 테스트를 통해 측정 한 후 안정한 세포주를 확립하는 것이 권장된다. 안정한 세포주는 독시사이클린 유도 (15)를 통해 조정 가능한 발현의 가능성을 가지고있다.
감염 후 세포는 일반적으로 퓨로 마이신과 각 구조에 대한 네오 마이신, 하나, 항생제로 선택됩니다. 샘플 준비, 이미지 수집 및 데이터 분석을위한 후속 단계는 프로토콜에 상세히 설명한다.
이 방법, 라스-Raf를 RBD의 BiFC-PALM 이미지에서 나노 클러스터의 형성이 정기적으로 관찰된다 (그림 2A </ STRONG>). 지속적으로, 라스-Raf를 RBD의 SMT-PALM 궤도는 확산 상태 (그림 2B-D)에서 이종 분포를 보여줍니다. 이러한 결과는 라스-Raf를 착체 잠재적 생물 함의 아마도 단량체 및 클러스터로서, 세포막의 여러 상태에 있는지 제안한다. 이 작업은 종래 BiFC 형광 공동 지역화 또는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 얻는 것이 어려울 수 나노 미터의 공간 해상도와 단일 분자 감도를 가진 세포에서의 프로톤 펌프 억제제의 선택적 이미징 BiFC-PALM의 전력을 나타낸다.
BiFC 실험을 설계하고 결과를 해석 할 때, BiFC 프로세스가 분할 PAmCherry1을 포함하여 대부분의 경우에 돌이킬 명심하는 것이 중요하다. 두 조각이 결합하여 완전한 PAmCherry1 단백질, 두 조각 사이의 결합을 형성하고, 일단 따라서 PPI는 영구된다. 이것은 BiFC과 BiFC-PAL의 사용을 제한프로톤 펌프 억제제의 역학 (즉, 결합 반응 속도가 아니라이 형성되면 단백질 복합체의 확산 역학)를 모니터링하고 시간에 M 심지어 PPI 단지의 mislocalization가 발생할 수 있습니다.
BiFC-PALM 실험을 설계하는 형광 단백질에 내재되어 발색단 성숙의 지연 인 경우 추가 요인을 고려해야한다. 두 단백질이 상호 작용하고 FP 조각이 함께 모여되면, 그들은 일반적으로 초 (EYFP 3 60 초 하프 타임)의 순서에 접힘. 그러나, 이후의 발색단의 성숙과 형광 신호 분 정도의 개발. 형광 분할 금성, 빨리 접는 YFP 변형의 재구성 후 10 분 이내에 검출 할 수 있지만, 일반적으로 성숙 하프 타임은 종종 약 60 분 (16)이다. 분할 PAmCherry1 비슷한 속도를 가지고 관찰 하였다. 따라서, BiFC과 BiFC-PALM 실시간 PPI 속도론을 모니터링 현재 가난한 선택할 수 있습니다; 다른 나FRET과 같은 최근 개발 된 이량 종속 형광 단백질 17 thods 등이 목적에 더 적합 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM 그대로 생체 시료의 나노 이미징을 가능하게하는 최근 단일 분자 수퍼 해상도 현미경 기법 동안 BiFC는 검출 셀에서 프로톤 펌프 억제제를 시각화 기술에 일반적으로 사용되어왔다. 손바닥 BiFC의 조합은 나노 미터 공간 해상도와 단일 분자 감도 세포 내에서 프로톤 펌프 억제제의 선택 영상을 달성했다. BiFC-PALM은 두 가지 기술의 유틸리티를 확장하고,이 연구에서 입증 된 바와 같이, 그 나라의 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
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