Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Summary

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la biologia ¹ e sono strettamente regolati attraverso meccanismi spazio-temporali attraverso molte tempo e lunghezza scale. Gli studi sulla segnalazione cellulare sulla membrana cellulare, ad esempio, hanno rivelato dinamici, scompartimenti spaziali nanoscala che facilitano PPI specifici e processi cellulari ^2. Quindi, la capacità di sondare PPI nei sistemi biologici con risoluzioni sufficienti spaziali e temporali, alta specificità e sensibilità elevata è la chiave per raggiungere una comprensione meccanicistica della biologia.

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) è uno dei pochi strumenti esistenti per la visualizzazione PPI in una cella con una risoluzione subcellulare e compatibilità live-cell ^3-5. La tecnica è relativamente semplice e comporta frazionamento di una proteina fluorescente in due frammenti non fluorescenti; quando geneticamente etichettati per due proteine ​​che interagiscono eportato in prossimità, i frammenti possono ricostituire per formare una proteina fluorescente completo, producendo segnale fluorescente. Se correttamente progettato, le sonde BiFC non dovrebbero ricostituire spontaneamente, in assenza di PPI. Come tale, il segnale di fluorescenza in un saggio BiFC sorgerà solo in presenza degli IPP, che consente la visualizzazione diretta degli IPP con elevata specificità. Ulteriori vantaggi di utilizzare la fluorescenza come la lettura sono alta sensibilità, risoluzione subcellulare, e compatibilità con l'alta produttività e alta test di screening di contenuti, tra gli altri. Per queste prestazioni, sono stati sviluppati una serie di sonde BiFC a base di proteine ​​fluorescenti genitore differenti. Come in tutte le altre tecniche di rilevazione basate sulla microscopia luce convenzionale, tuttavia, la risoluzione spaziale di BiFC è limitata a ~ 250 nm dalla diffrazione della luce. Questo lo rende una sfida per studiare la regolazione di PPI su scala nanometrica, che, come accennato in precedenza e esemplificato da un raft lipidici ⁶nd nanocluster Ras ^7, è una scala di lunghezza fondamentale per comprendere molti processi cellulari, come la segnalazione.

BiFC è stato combinato con la microscopia localizzazione fotoattivato ^(PALM) 8,9 per superare questo limite a risoluzione spaziale per l'imaging PPI ^10. PALM è una recente tecnica di microscopia Super Risoluzione che aggira il limite di diffrazione di imaging di fluorescenza attraverso l'attivazione stocastico e localizzazione subdiffractive di molecole fluorescenti singoli. In ogni ciclo di attivazione, una molecola fluorescente emette poche centinaia a qualche migliaio di fotoni e dà luogo ad una singola immagine Molecola sul rivelatore. Mentre l'immagine è diffrazione limitata (~ 250 nm in larghezza), il suo baricentro può essere determinata con precisione molto maggiore, tipicamente dell'ordine di 10-50 nm in funzione del numero di fotoni rilevati. Attivando e localizzare ogni molecola fluorescente del campione, una immagine ad alta risoluzione può essere ricostruita. Performed su cellule viventi, singola molecola tracking (all'SMT) PALM ulteriori permessi acquisizione di migliaia di traiettorie di diffusione proteine ​​da una singola ^cella 11. È importante sottolineare che, PALM utilizza sonde fluorescenti specializzati come proteine ​​fluorescenti fotoattivabile (PA-PQ) per ottenere l'attivazione stocastico. Dal momento che sia BiFC e proteine ​​fluorescenti uso PALM, sono stati combinati dividendo PAmCherry1, un comunemente usato PA-FP per PALM, in due frammenti tra aminoacidi 159 e 160.

Il sistema basato su PAmCherry1 BiFC scissione mostra basso segnale di fondo da ricostituzione spontanea dei due frammenti. Quando geneticamente etichettato ad una coppia di proteine ​​interagenti, i due frammenti (RN = residui 1-159; RC = Met + residui 160-236) ricostituito in modo efficiente per formare le proteine ​​complete PAmCherry1 anche a 37 ° C e senza incubazione a temperature più basse, che non è il caso per altre coppie BiFC ^12, come il genitore mCherry ^13. Furthermore, la proteina PAmCherry1 ricostituito mantenuto le proprietà fotofisiche del PAmCherry1 genitore, come l'elevato rapporto di contrasto, resa fotoni media, e fotoattivazione veloce, tra gli altri, che sono fondamentali per la localizzazione precisa di singola molecola e immagini ad alta risoluzione PALM.

In questo protocollo, l'uso di BiFC-PALM per l'imaging interazioni Ras-Raf in cellule U2OS utilizzando PAmCherry1 split (Figura 1A) è descritta. Il primo passo è quello di progettare i costrutti per l'espressione di proteine ​​di fusione tra i frammenti PAmCherry1 (cioè, RN e RC) e le proteine ​​di interesse. In teoria, per ogni coppia di proteine ​​candidati (A e B), vi sono otto coppie di proteine ​​di fusione da testare: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; e A-RC / B-RN. Spesso il processo può essere semplificato tenendo conto delle proprietà strutturali o biochimiche delle proteine ​​candidate. Nel caso di Ras, la proteina èpost-traduzionale modificato nella casella CAAX C-terminale (C = Cys; A = alifatici; X = qualsiasi), dopo di che il motivo AAX viene aperto fuori. Quindi, RN o RC possono essere fuse solo al N-terminale di Ras; Questo riduce il numero di coppie di proteine ​​di fusione di quattro (Figura 1B). Per Raf, dominio Ras vincolanti (RBD; residui 51-131) viene utilizzato e possono essere contrassegnati su entrambe le estremità. Sono stati generati Queste quattro configurazioni di fusione: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; e RC-KRAS / Raf RBD-RN.

Inoltre, il linker tra i frammenti e le proteine ​​di interesse deve essere considerato. Un linker flessibile di circa dieci amminoacidi è spesso usato in quanto fornisce sufficiente libertà per complementazione a verificarsi. Uno di questi è linker (GGGGS) x2, anche se ci sono molti altri che sono state applicate con successo, tra cui sequenze casuali generati da un sito di clonazione multipla (MCS) ^14. La lunghezza dei linker può avere bisogno di essere ottimizzato depending delle dimensioni delle proteine ​​di interesse e il loro orientamento quando interagenti.

I frammenti PAmCherry1 sono contenuti in una piccola spina dorsale di clonazione con accompagnamento MCSs (vedi Lista dei materiali). I geni di interesse possono essere inseriti attraverso i siti di restrizione o con un metodo di legatura indipendente. Dopo la verifica clonazione e la sequenza, la cassetta di espressione viene trasferito in un vettore di espressione mediante una reazione ricombinasi, un processo di clonazione con alta fedeltà e ad alta efficienza.

Successivamente, i costrutti di espressione risultanti vengono trasfettati nella linea cellulare di destinazione o, se una linea cellulare stabile è desiderato, confezionato in lentivirus per infettare la linea cellulare di destinazione. Trasfezione transitoria consente di convalida rapida delle configurazioni BiFC, ma i potenziali problemi deve essere notato. Trasfezione utilizzo di sostanze chimiche spesso sottolinea le cellule, con conseguente forte autofluorescenza; mentre l'uso di riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopy può attenuare questo segnale di fondo limitando il volume illuminazione, TIRF ideale quando le IPP avvengono sulla membrana cellulare. Inoltre, trasfezioni transienti portano spesso ad alti livelli di espressione della proteina, di gran lunga superiori a quelli delle proteine ​​endogene, che possono causare artefatti nel rilevare i PPI. Pertanto, si raccomanda che le linee cellulari stabili essere stabiliti dopo una configurazione BiFC appropriata è stata determinata attraverso prove iniziali. Linee cellulari stabili hanno anche la possibilità di espressione sintonizzabile tramite induzione doxiciclina ^15.

Dopo l'infezione, le cellule sono selezionate con antibiotici, tipicamente puromicina e neomicina, uno per ciascun costrutto. Le fasi successive per la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini, e l'analisi dei dati verranno descritti in dettaglio nei protocolli.

Con questo approccio, la formazione di cluster in nanoscala nelle immagini BiFC-PALM di Ras-Raf RBD sono comunemente osservati (Figura 2A </ strong>). Coerentemente, traiettorie SMT-PALM di Ras-Raf RBD mostrano una distribuzione eterogenea negli stati di diffusione (figura 2B-D). Questi risultati suggeriscono che esistono complessi Ras-Raf in più stati sulla membrana cellulare, presumibilmente come monomeri e cluster, con potenziali implicazioni biologiche. Questo lavoro dimostra la potenza di BiFC-PALM nell'imaging selettiva di PPI in cellule con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola, che sarebbe difficile da ottenere con BiFC convenzionale, a fluorescenza co-localizzazione o la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET).

Nel progettare gli esperimenti BiFC e interpretare i risultati, è importante tenere a mente che il processo è irreversibile BiFC nella maggior parte dei casi, di cui PAmCherry1 spaccato. Una volta che i due frammenti uniscono e formano una proteina PAmCherry1 completa, il collegamento tra i due frammenti, e quindi la PPI diventa permanente. Questo limita l'uso di BiFC e BiFC-PALM per monitorare la dinamica dei PPI (cioè, la cinetica di legame e non la dinamica di diffusione del complesso proteico volta che è formata) e, a volte potrebbe anche portare alla mislocalization dei complessi PPI.

Un ulteriore fattore da considerare nella progettazione di esperimenti BiFC-Palm è il ritardo nella maturazione cromoforo che è insita in proteine ​​fluorescenti. Dopo due proteine ​​interagiscono ei frammenti FP si incontrano, in genere ripiegare dell'ordine di secondi (primo tempo di 60 sec per EYFP ^3). Tuttavia, la successiva maturazione cromoforo e segnale fluorescente sviluppano dell'ordine di minuti. Mentre fluorescenza può essere rilevabile entro 10 minuti dopo la ricostituzione del split-Venere, un fast-pieghevole variante YFP, il primo tempo per la maturazione in generale è spesso circa 60 ^min 16. Split-PAmCherry1 è stato osservato ad avere tassi simili. Quindi, BiFC e BiFC-PALM sono scelte attualmente poveri per monitorare la cinetica PPI in tempo reale; altro mithods, come FRET e dimerizzazione recentemente sviluppato proteina fluorescente dipendente ^17, può essere più adatto per questo scopo.

Protocol

1. Clonazione Determinare le configurazioni per clonare e scegliere un linker. Proteine ​​tag con i frammenti sul N- o C-terminale come descritto di seguito in modo da non interrompere la loro localizzazione corretta. Utilizzare un linker flessibile come (GGGGS) x2. Geneticamente contrassegnare le proteine ​​di interesse ai frammenti PAmCherry1. Come un'opzione, utilizzare i plasmidi clonazione elencate nella Lista dei materiali contenente il frammenti RN (residui PAmCherry1 1-159) e RC …

Representative Results

L'esempio BiFC-PALM mostrata è KRAS G12D mutante interagire con Ras legame dominio (RBD) del CRAF (Figura 1A). Come discusso, la RN o frammenti RC non contrassegnati al C-terminale di Ras perché interromperebbe la localizzazione di membrana e quindi l'attività biologica di Ras. Questo riduce le possibili combinazioni da otto a quattro (Figura 1B). Ciascuno di questi quattro combinazioni stato introdotto in cellule U2OS utilizzando infezione lentivirale. Le cellule sono state …

Discussion

BiFC è una tecnica comunemente usata per il rilevamento e la visualizzazione PPI nelle cellule, mentre PALM è una recente tecnica di microscopia molecola SuperResolution unico che permette l'imaging su nanoscala di campioni biologici intatti. La combinazione di BiFC con PALM raggiunto l'imaging selettivo di PPI all'interno di una cella con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola. BiFC-PALM estende l'utilità di entrambe le tecniche, e come dimostrato in questo lavoro, mostra un…

Materials

TIRF Microscope	Nikon
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Coherent
405 nm laser	Coherent
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25×36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 mL tubes	Fisher	05-539-12
5 mL  polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 mL polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 mL tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks