Planar पर एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी bilayers समर्थित

Summary

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Abstract

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues ¹. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light ². Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode ^3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Introduction

कार्रवाई के अपने मोड अक्सर पारंपरिक जैव रासायनिक तरीके से पता लगाने और मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल हो जाता है, जो कम आत्मीयता बातचीत, द्वारा परिभाषित कर रहे हैं क्योंकि झिल्ली प्रोटीन उनके सेलुलर कार्य को पूरा तंत्र है जिसके द्वारा समझ अक्सर, एक चुनौतीपूर्ण काम हो सकता है। झिल्ली प्रोटीन इसके अलावा अत्यधिक सिद्धांत रूप में उनके जैविक गतिविधि ⁷ को बदल सकता है, जो विशिष्ट झिल्ली डोमेन ^5,6 या गतिशील उच्च आदेश संरचनाओं फार्म में समृद्ध बनाया जा सकता है।

गैर इनवेसिव लेजर की सहायता एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इस प्रकार जटिल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकल्प की पद्धति बन गया है। इन सिद्धांत में शोर कम कुल आंतरिक परावर्तन (TIRF) मोड में नजर रखी जा सकती है, क्योंकि यह विशेष रूप से प्लाज्मा झिल्ली में जगह लेने के जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के लिए सच है। यहाँ नमूना रोशनी एक गिलास सु पास में 200 एनएम पतली टुकड़ा करने के लिए एक अप करने के लिए प्रतिबंधित हैयह भी प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता ^8,9 में पर्याप्त वृद्धि के कारण, क्षणभंगुर उत्तेजना प्रकाश की विशेषताओं के लिए, सेलुलर पृष्ठभूमि में एक महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम है और जो rface। एक अणु का पता लगाने में उच्च स्थितीय और अस्थायी समाधान के लिए लक्ष्य जब दोनों पहलुओं से महत्वपूर्ण हैं।

तलीय SLBs TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ ही संगत नहीं हैं। उचित ligands के साथ क्रियाशील जब वे भी वे प्रतिरक्षा कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं में पाए जाते हैं के रूप में सेल सेल मान्यता की आणविक गतिशीलता के अध्ययन के लिए सीधी पहुँच प्रदान करते हैं। उन्होंने यह भी बस ऐसी कोशिकाओं अति आवश्यक है जो TIRF रोशनी में imaged किया जा सकता है, ताकि कांच स्लाइड के लिए काफी करीब गतिशील और अन्यथा गैर पक्षपाती कोशिकाओं की स्थिति के लिए उपयोग किया जा सकता है, जब एक अणु ट्रैकिंग या एक अणु-आधारित superresolution शामिल चालन प्रयोगों। यह अंत करने के लिए प्रोटीन एक अत्यधिक मोबाइल SLB पर लोड किया जाना है। इस्तेमाल किया ली का एक अंतर्निहित लाभ पीआईडी ​​पर सभी प्रोटीन का कोई unspecific बाध्यकारी है कि वहाँ रहे हैं। इसके अलावा, SLBs खुद को चंगा करने के लिए एक अंतर्निहित क्षमता के साथ दो आयामी तरल पदार्थ के रूप में माना जा सकता है; कांच समर्थन के भीतर अनियमितताओं एक निश्चित डिग्री करने के लिए मुआवजा दिया जाता है। एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल हित के प्रोटीन के साथ आरोप लगाया अत्यधिक मोबाइल bilayers उत्पन्न करने के लिए प्रदान की जाती है। तलीय SLBs के गठन के मुख्य घटक (90-99%) और सिंथेटिक के रूप में एक-palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन.-ग्लिसरो-3-phosphocholine (POPC) होते हैं, जो वर्णित है और लिपिड 1,2-dioleoyl- क्रियाशील है एस.एन. -glycero-3 – {[एन (5-अमीनो-1-carboxypentyl) iminodiacetic एसिड] succinyl} निकल नमक कम बहुतायत (1-10%) में (डीजीएस NTA-नी)। POPC एक संतृप्त फैटी एसिड और एक मोनो असंतृप्त वसीय अम्ल किया जाता है और यहां तक ​​कि आरटी पर उच्च तरलता की लिपिड bilayers रूपों। डीजीएस NTA-नी पाली हिस्टिडीन पूंछ को अपने headgroup साथ बांधता है और अपनी पसंद की पाली हिस्टिडीन टैग प्रोटीन (चित्रा 1) के लिए लंगर के रूप में कार्य करता है।

"> महत्वपूर्ण बात है, माइक्रोस्कोपी हार्डवेयर उपलब्ध कराई गई जानकारी और प्रकाशिकी और लेजर भौतिकी में कुछ बुनियादी ज्ञान के साथ, किसी भी जीवविज्ञानी एक अणु इमेजिंग सेटअप का निर्माण करने में सक्षम होना चाहिए। नीचे बताए गए हैं जो बाह्य उपकरणों के एक नंबर शामिल करना चाहिए। नमूना उत्तेजना आदर्श होना चाहिए कुल आंतरिक परावर्तन (TIRF) मोड में एक औंधा माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन इस आहार इसके लिए एक विशेष TIRF सक्षम उद्देश्य (देखें नीचे)। नकली प्रकाश और सेलुलर ऑटो प्रतिदीप्ति ⁹ से अन्यथा परिणामस्वरूप अत्यधिक पृष्ठभूमि कम कर देता है और लेजर रोशनी की जरूरत है के रूप में। कुछ प्रयोगों मिलीसेकंड सीमा के भीतर रोशनी समय की आवश्यकता होती है और तेजी से उत्तराधिकार में संचालित होगा। रोशनी समय बचाने के लिए या इसे दो या अधिक वर्णक्रम चैनलों में उत्सर्जित प्रकाश विभाजित करने के लिए अक्सर उपयोगी है दोहराए रोशनी की वजह से अनावश्यक विरंजन से बचने के लिए। यह एक साथ readout के लिए अनुमति देता है जब conduc एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है, जो दो या दो से अधिक उत्सर्जन प्रोफाइल, कीForster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) को शामिल टिंग प्रयोगों। यहाँ एक उत्तेजना प्रकाश नाड़ी से उत्पन्न उत्सर्जन दोनों झल्लाहट दाता से दर्ज की गई और (अवगत उत्सर्जन के रूप में) स्वीकर्ता झल्लाहट जा सकता है। कैमरा रोशनी के समय के दौरान एकल fluorophores कल्पना करने के लिए पर्याप्त रूप से कम पृष्ठभूमि के साथ पर्याप्त फोटॉनों पर कब्जा करना चाहिए। कम्प्यूटर सॉफ्टवेयर उत्तेजना बंद और छवि अधिग्रहण सिंक्रनाइज़ करने के लिए कार्य करने के लिए रहना होगा। एक व्यापक सिंहावलोकन नीचे और चित्रा 2 में दिया जाता है:

TIRF सक्षम उद्देश्य: उद्देश्य आधारित TIRF रोशनी के लिए उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के बराबर या मानक गिलास स्लाइड का उपयोग कर 1.4 से बड़ा होना चाहिए (एन = 1.515) ^9। बढ़ाई 150x के लिए 60x के बीच हो सकती है। उद्देश्य वार्णिक अलग fluorophores जब इमेजिंग confocality के लिए अनुमति देने के लिए सही किया जाना चाहिए।

लेजर: उपलब्ध लेस की संख्याआर विकल्प काफी पिछले वर्षों में वृद्धि हुई है। आधुनिक इलेक्ट्रॉनिक रूप modulatable निरंतर तरंग लेजर डायोड लागत प्रभावी रहे हैं और अभूतपूर्व आवृत्ति और गति के साथ संचालित किया जा सकता है। अधिक महंगी गैस आयन लेज़रों लेजर बीम गुणवत्ता में उत्कृष्टता, लेकिन ठंडा बाहरी बंद (देखें नीचे) और अक्सर व्यापक (पानी) की आवश्यकता होती है।

उत्तेजना के दरवाज़े: acousto ऑप्टिकल माड्युलेटर्स (AOM) तेजी से उत्तराधिकार ^{में 10} में तेजी से बंद अनुमति देते हैं। तंग यांत्रिक बंद के साथ एक AOM के संयोजन बंद करने के लिए सिफारिश की है। कारण निरंतर प्रकाश जोखिम को AOM का यह तरीका व्यापक हीटिंग बचा है और बंद की स्थिति में AOM से लीक प्रकाश बाहर रद्द कर दिया है।

लेंस लेजर बीम को चौड़ा करने के लिए और उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर उन्हें ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस तरह, उत्तेजना प्रकाश की TIRF रोशनी के लिए आवश्यक है, जो एक समानांतर बीम (चित्रा 3) के रूप में उद्देश्य के पत्तोंनमूना। उद्देश्य की परिधि में केंद्र से वापस फोकल हवाई जहाज़ के भीतर केन्द्र बिन्दु चल रहा किरण उद्देश्य को छोड़ देता है, जिस पर कोण बदल सकते हैं, लेकिन एक समारोह नमूना पर लेजर स्थान के स्थान (चित्रा 3) है, जो न होगा समग्र किरण ज्यामिति की। TIRF रोशनी उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ के भीतर लेजर का केन्द्र बिन्दु अनुवाद करने के लिए एक पेरिस्कोप के रूप में कार्य दर्पण का एक सेट का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है, जो एक महत्वपूर्ण कोण, पर ensues। लेंस वार्णिक सही किया जाना चाहिए और दो या तीन लेंस का एक सेट में इस्तेमाल किया जा सकता है। तीन लेंस प्रणाली उद्देश्य (चित्रा 4) के पीछे फोकल हवाई जहाज़ में चौड़ी बीम ध्यान केंद्रित करने के लिए लेजर बीम (और इसलिए नमूना पर रोशनी स्थान) और एक तिहाई लेंस को चौड़ा करने के लिए एक दूरबीन के रूप में अभिनय दो लेंस के होते हैं। दोनों कार्यों (दूरबीन और ध्यान केंद्रित) भी केवल दो लेंस के संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 4 देखें)।

<p class="Jove_content"> दर्पण लेजर प्रकाश के नुकसान से बचने के लिए कम से कम 95% चिंतनशील होना चाहिए। दो दर्पण का एक सेट आमतौर पर ऐसी व्यवस्था के रूप में लागू किया जाता है प्रत्येक बीम समायोजन के लिए ठीक एक लेजर बीम के किसी भी कोण और स्थिति को समायोजित करने के लिए पर्याप्त है।

Dichroic ओवरले प्रतिबिंबित और अलग निर्दिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश संचारित और मिलाना या दो लेज़रों की कड़ियां विभाजित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

Polychroic फिल्टर dichroic फिल्टर की तुलना में अधिक जटिल हैं और आने वाली उत्तेजना प्रकाश को प्रतिबिंबित और नमूना से उत्सर्जन प्रकाश बाहर निकलने संचारित करने के लिए आवश्यक हैं। वे उद्देश्य और माइक्रोस्कोप ट्यूब लेंस के बीच फिल्टर क्यूब में रखा जाता है।

फिल्टर को साफ: लेजर नौकर डी लेजर के प्रकार पर निर्भर करता है यह लेजर के पत्तों सही होने के बाद लेजर बीम में रखा जाना चाहिए, एक संकीर्ण संचरण बैंडविड्थ के साथ फिल्टर को साफ।

पायदान फिल्टरप्रभावी रूप से एक संकीर्ण बैंडविड्थ के साथ लेजर प्रकाश को अवशोषित और सभी अन्य प्रकाश संचारित करने के लिए तैयार कर रहे हैं। वे किसी भी नकली लेजर उत्तेजना प्रकाश को फिल्टर करने के लिए उत्सर्जन पथ के भीतर रखा जाता है। हालांकि, पायदान फिल्टर 0 डिग्री भेजे गए कोण पर ही काम करते हैं। निशान फिल्टर का बैंड-चौड़ाई बहुत तेज है, तो अलग भेजे गए कोण किसी भी अधिक परिलक्षित नहीं किया जा सकता है। Collimated लेजर लेजर प्रकाश के अवरुद्ध प्रभावित नहीं है, लेकिन वापस बिखरे प्रकाश कुशलतापूर्वक कैमरा पहुंचने से रुकावट नहीं किया जा सकता है।

Ratiometric के लिए एक क्सीनन या पारा चाप दीपक के सामने रखा जब उपयुक्त फिल्टर पहियों के साथ सुसज्जित मोटर चालित फिल्टर पहियों आसानी से उत्तेजना और उत्सर्जन मार्ग में रखा गया है और अलग तरह के प्रकाश की तीव्रता (एन डी फिल्टर के साथ सुसज्जित जब) या फ्लोरोसेंट चैनल (बीच सरल स्विचिंग की अनुमति देने की जा सकती है कैल्शियम इमेजिंग या कैमरे के सामने) उत्सर्जन fluorophore के लिए चयन करने के लिए।

50:50 घन बीम फाड़नेवाला गएक दो अलग-अलग उत्तेजना किरण पथ में लेजर बीम विभाजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी पेरिस्कोप के सामने उन्हें गठबंधन करने के लिए।

बीम फाड़नेवाला (उत्सर्जन पथ): शारीरिक फिल्टर परिवर्तन के लिए किसी की जरूरत के बिना तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए, उत्सर्जन बीम एक स्थानांतरित-नीले और लाल स्थानांतरित चैनल में विभाजित है। सिद्धांत रूप में, बीम splitters एक dichroic कील या दर्पण का एक सेट और एक तरंग दैर्ध्य पर निर्भर तरीके में उत्सर्जन किरण अलग करने के लिए एक dichroic दर्पण को रोजगार से बनाया जा सकता है। दो उत्सर्जन फिल्टर उत्सर्जित चैनलों को साफ करने की जरूरत है।

स्थानिक फिल्टर: उत्तेजना बीम के स्थानिक छानने कभी कभी कम गुणवत्ता लेजर बीम से उत्सर्जित गैर समानांतर प्रकाश किरणों को दूर करने के लिए आवश्यक है। एक स्थानिक फिल्टर दोनों लेंस का केन्द्र बिन्दु पर बिल्कुल रखा एक छोटा सा पिनहोल के साथ एक दो लेंस दूरबीन के होते हैं। लेजर बीम की गैर समानांतर भागों से उत्पन्न इस तरह नकली प्रकाश कुशलता से अवरुद्ध हो जाता है। रTIRF आधारित माइक्रोस्कोपी की स्थापना जब चर्चा शर्तों को पूरा किया जाना चाहिए। केन्द्र बिन्दु में है, और पहले लेंस के छोटे फोकल लंबाई के साथ स्थिति को और अधिक मुश्किल हो जाता है, जो छोटे पिनहोल साथ स्थानिक छानने बढ़ जाती है। लेंस भटकाव की वजह से प्रभाव कम करने के लिए यह बजाय साधारण लेंस कम बढ़ाई (10x या 20x) के साथ उच्च गुणवत्ता और अनंत को सही माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के रोजगार के लिए फायदेमंद है।

पेरिस्कोप: एक पेरिस्कोप सेटअप उद्देश्य, TIRF इमेजिंग के लिए एक शर्त के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के भीतर केंद्रित लेजर बीम का अनुवाद करने के लिए आवश्यक है। यह आसानी से दो दो इंच दर्पण, पहले दर्पण और चौड़ी और माइक्रोस्कोप में उत्तेजना बीम ध्यान केंद्रित (चित्रा 5) को प्रतिबिंबित करने के लिए दूसरे दर्पण स्थिति के लिए एक के बाद एडजस्ट करने के लिए एक translational मंच से बनाया जा सकता है।

कैमरा: वापस प्रबुद्ध इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज कपल्ड डिवाइस (EMCCD) को नियमित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंएक अणु संकेतों की रिकॉर्डिंग। इस वजह से उनकी उच्च मात्रा दक्षता के उच्च अधिग्रहण की गति, (95% तक) (30 से ऊपर मेगाहर्ट्ज) और अपेक्षाकृत कम शोर है। -80 डिग्री सेल्सियस तक नीचे ठंडा थर्मल शोर कम कर देता है और वर्तमान में उपलब्ध EMCCD कैमरों के एक नंबर के द्वारा समर्थित है। EMCCD प्रौद्योगिकी की एक सीमा है कि कैमरे के शोर कैमरा लाभ दोनों के साथ रैखिक बढ़ जाती है और संकेत कब्जा किया जा रहा है। इस वजह से sCMOS चिप के विशेष स्थापत्य कला के लिए भी बहुत तेजी से EMCCD कैमरों की तुलना में काफी कम महंगे हैं और काम करते हैं, जो वैज्ञानिक CMOS (sCMOS) कैमरों के साथ ऐसा नहीं है। प्रत्येक पिक्सेल अलग संवेदनशीलता का पता लगाने की सुविधा है क्योंकि हालांकि CMOS प्रौद्योगिकी के साथ जुड़े एक समस्या यह है कि छवि अधिग्रहण अभी भी एक ही अणु के स्तर पर एक मात्रात्मक readout के कुछ डिग्री का अभाव है। प्रिंसिपल में इस पिक्सेल सामान्य बनाने के माध्यम से मुआवजा दिया जा सकता है, लेकिन इस प्रक्रिया ^{में 11} तुच्छ से कोई मतलब है। यह है कि हम अभी भी फिर से करने में संकोच क्यों हैएक अणु माइक्रोस्कोपी के लिए sCMOS कैमरों की सराहना करता हूं, लेकिन इस प्रौद्योगिकी के तेजी से विकास के मद्देनजर, sCMOS कैमरों जल्द ही पसंद का कैमरा हो सकता है। धीरे स्कैन सीसीडी कैमरों कैमरों सब एक साथ प्रवर्धन से संबंधित शोर और पिक्सेल विचरण से बचने और वे एक तथाकथित 'गतिज' मोड में संचालित किया जा सकता है, तो सबसे तेजी से अधिग्रहण दरों समर्थन करते हैं। इस मोड ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को छोड़कर पूरे कैमरा चिप में यह संभव है एक भंडारण युक्ति के रूप में चिप ही काम करने के लिए आता है, जो छिपा हुआ है। रॉय के लिए पहली बार सामने आ रहा है के बाद, जिसके परिणामस्वरूप आरोपों छवि आगे प्रकाश जोखिम से सुरक्षित है, जहां पिक्सेल लाइन द्वारा चिप पिक्सेल लाइन का नकाबपोश क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया जाता है। नकाबपोश क्षेत्र में रॉय के सभी लाइनों के स्थानांतरण (उप millisecond रेंज में) पूरा हो जाने के बाद, रॉय खुद को अगले प्रदर्शन के लिए तैयार है। सीसीडी चिप के सभी पिक्सेल लाइनों चार्ज किया जाता है, जब तक यह चक्र दोहराया है। चिप तो स्पष्ट रूप से Redu के साथ धीरे-धीरे बाहर पढ़ने के लिए हैCED readout शोर। एक 1000 x 1300 पिक्सेल चिप पर उदाहरण के लिए, 50×50 पिक्सेल के 20 ROIs तेजी से उत्तराधिकार में दर्ज किया जा सकता है। छवियों बाहर पढ़ने के लिए जा रहा से पहले एक काफी समय के लिए चिप पर बने हुए हैं, क्योंकि यह अत्यधिक थर्मल शोर को कम करने के लिए एक साधन के रूप में (तरल नाइट्रोजन के साथ उदाहरण के लिए) के लिए उच्च गुणवत्ता मास्किंग सुनिश्चित करने के लिए और कैमरा शांत करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ EMCCD कैमरों भी गतिज मोड समर्थन करते हैं।

सॉफ्टवेयर: लेजर, दरवाज़े, AOMS और कैमरा जोखिम के समय के रूप में अच्छी तरह से उचित छवि भंडारण किसी भी सफल इमेजिंग प्रयोग का अभिन्न अंग हैं। प्रिंसिपल कई परिभाषित संचालन कैमरा के साथ आते हैं कि उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल के साथ प्रोग्राम किया जा सकता है। वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर संकुल थोड़ा तकनीकी जानकारी के साथ लागू किया जा सकता है, जो हार्डवेयर peripherals की एक बड़ी संख्या को समर्थन करते हैं।

पल्स जनरेटर, डाटा अधिग्रहण (DAQ) (एनालॉग और डिजिटल उत्पादन चैनलों के साथ) बोर्ड और आस्टसीलस्कप: एक पल्स जनरेटर है एकउत्कृष्ट पसंद निर्धारित समय और वोल्टेज की दालों में ट्रिगर दालों बदलने के लिए। इस तरह लेज़रों ठीक बिजली उत्पादन के लिए नियंत्रित और उप millisecond रेंज को मिलीसेकंड में समय पर किया जा सकता है। एनालॉग आउटपुट के साथ DAQ बोर्डों उसी को प्राप्त है और आसानी से पीसीआई स्लॉट के माध्यम से कंप्यूटर के मदरबोर्ड में एकीकृत कर रहे हैं। पल्स अवधि, आयाम और आवृत्ति एक आस्टसीलस्कप के साथ सत्यापित कर रहे हैं।

पूरे उत्तेजना किरण पथ के बाड़े: कारण पूरे उत्तेजना किरण पथ अपनी प्रयोगशाला वातावरण से संलग्न किया जाना चाहिए हवा convections को उत्तेजना प्रोफ़ाइल में उतार-चढ़ाव से बचने के लिए। TIRF माइक्रोस्कोपी का आयोजन करते हैं तो यह उपाय विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। ऑप्टिकल घटकों को भी धूल और लेजर प्रकाश जोखिम से मानव आँख से सुरक्षित हैं। बाड़ों आसानी से कला की आपूर्ति भंडार में खरीदा जा सकता है, जो काले कार्ड बोर्ड से निर्माण किया जा सकता है।

Photobleac बाद SLB प्रतिदीप्ति वसूली की तरलता निर्धारित करने के लिएहिंग (FRAP) के मापन के ¹² प्रदर्शन कर रहे हैं। FRAP के लिए दो उत्तेजना किरण पथ का अस्तित्व (चित्रा 3 देखें) की सलाह दी जाती है। पहली किरण पथ छवि के लिए bilayer के प्रतिदीप्ति बनाया गया है। इस TIRF विन्यास में और कम प्रकाश की तीव्रता के साथ किया जा सकता है। यह ऑप्टिकल अक्ष के साथ उद्देश्य छोड़ देता है, ताकि दूसरे किरण पथ, एक छोटी लेकिन तीव्र ब्लीच नाड़ी के लिए अनुमति चाहिए और गैर-TIRF मोड में विन्यस्त किया जाना चाहिए। एक दौर एपर्चर उत्तेजना किरण पथ में रखा जा सकता है परिभाषित किनारों के साथ एक पूरी तरह गोल ब्लीच प्रोफ़ाइल परियोजना के लिए (8 चित्रा देखें)। छवि के लिए आदेश में वस्तु विमान पर इस एपर्चर, अपने इष्टतम स्थिति (चित्रा 3 देखें) लेंस 3 के फोकल हवाई जहाज़ में किया जाएगा। एपर्चर थोड़ा स्थानांतरित कर दिया पदों पर रखा गया है हालांकि, जब इस वजह से यह लेंस की लंबी फोकल लंबाई करने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता का एक एपर्चर छवि भी उत्पन्न हो सकता है।

प्रदर्शन टी होने के बादवह कच्चे डेटा उचित रूप से विश्लेषण किया जाना चाहिए प्रयोग इमेजिंग। कई कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्राप्त करने और डेटा का विश्लेषण करने, मुख्य सेटिंग्स (जैसे रोशनी शक्ति और समय, TIRF कोण) के समायोजन को कवर किया है, जो पेशकश कर रहे हैं।

Protocol

1. जनरेशन और Planar SLBs की functionalization लिपिड का मिश्रण एक 10% डीजीएस NTA-नी / 90% POPC लिपिड रचना पर पहुंचने के लिए एक 250 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क में क्लोरोफॉर्म में POPC और 6.9 मिलीग्राम डीजीएस NTA-नी की 45 मिलीग्राम भंग। अगले चरण में यह लुप्त हो जाना क्लोरोफॉर्म कम (अभी कई एमएल) की मात्रा रखें। एक 1% डीजीएस NTA-नी / 99% POPC लिपिड रचना के लिए 49.5 मिलीग्राम POPC और 0.69 मिलीग्राम डीजीएस NTA-नी का उपयोग करें। धीरे-धीरे एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर क्लोरोफॉर्म निकालें – परिवेश के तापमान से ऊपर वृद्धि आवश्यक नहीं है। वैकल्पिक रूप से, जैसे नाइट्रोजन या आर्गन के रूप में अक्रिय गैस की एक धारा में एक रासायनिक हुड के अंदर इसे बंद झटका। जबकि यह कर लगातार दौर नीचे कुप्पी के निचले आधे पर सुखाने लिपिड के बराबर बयान अनुमति देने के लिए कुप्पी की बारी है। क्लोरोफॉर्म के बहुमत सुखाया जाता है एक बार, मात्रात्मक क्लोरोफॉर्म दूर करने के लिए हे / एन वैक्यूम फ्लास्क देते हैं। नोट: यह कदम संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैबाद के चरणों में विषाक्त क्लोरोफॉर्म के साथ प्रोटीन और कोशिकाओं की और लिपिड bilayer तरलता सुनिश्चित करने के लिए। सूखे लिपिड से छोटे unilamellar पुटिकाओं (एसयूवी) की पीढ़ी नोट: छोटे unilamellar पुटिकाओं (एसयूवी) व्यास में 20 एनएम और 100 एनएम के बीच होते हैं और आसानी से स्नान sonication द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। लिपिड बाहर निकालना, एक वैकल्पिक तरीका, बाहर निकालना के लिए आवेदन किया फिल्टर के छेद के आकार पर निर्भर करता है, एसयूवी को जन्म दे सकते हैं और भी बड़े unilamellar पुटिकाओं (LUVs), आकार में 100 एनएम से 1000 एनएम जो कर रहे हैं। हालांकि, एसयूवी SLBs के गठन के लिए सबसे उपयुक्त हैं। स्नान sonication के माध्यम से एसयूवी (वीडियो में दिखाया गया है): Degass पीबीएस। 10 मिलीलीटर में दौर नीचे कुप्पी पीबीएस degassed 250 मिलीलीटर के साथ सूखे लिपिड मिश्रण निलंबित। , जैसे नाइट्रोजन या आर्गन के रूप में अक्रिय गैस के साथ फ्लास्क भरने एक डाट के साथ बंद हुआ और आटोक्लेव टेप के साथ कुप्पी सील। एक स्नान sonicator में सील कुप्पी की जगह और लिपिड निलंबन एक sonicateटी 120 170 डब्ल्यू करने के लिए यह स्पष्ट कर दिया गया है जब तक। इस बीच 30 और 60 मिनट लगते हैं। पुटिका गठन Spectro-photometrically की प्रगति की निगरानी: पीबीएस की तुलना में undiluted पायस के अवशोषण (लिपिड एकाग्रता के लिए एक अनुमानित सूचक के रूप में) 234 एनएम पर निरंतर बनी हुई है अभी तक के कारण के माध्यम से कम रोशनी बिखरने के लिए (550 एनएम पर काफी छोड़ देना चाहिए कि पीछा करना बड़े कणों)। एक सन्निहित SLB के गठन के साथ हस्तक्षेप जो भारी गैर unilamellar पुटिकाओं, गोली, 288.000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए तो 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 150,000 XG पर centrifugation द्वारा पुटिका निलंबन गोली और। 0.2 माइक्रोन का एक ताकना व्यास के साथ एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर। पुटिका तैयारी की स्पष्टता और लिपिड बाईं की राशि की निगरानी के लिए 234 एनएम और 550 एनएम पर आयुध डिपो उपाय। आर्गन या नाइट्रोजन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर पुटिकाओं स्टोर। वैकल्पिक रूप से, बाईलेयर तैयारी के लिए पुटिका निलंबन का उपयोगकई महीनों के लिए। लिपिड बाहर निकालना के माध्यम से एसयूवी: संक्षेप में, 0.1 माइक्रोन से एक छेद के आकार के साथ एक फिल्टर के माध्यम से लिपिड निलंबन कई बार गुजरती हैं। भले ही निर्माण विधि के, दो बार पुटिका निलंबन अपकेंद्रित्र (1H, 150,000g, 25 डिग्री सेल्सियस, तो 8h, 4 डिग्री सेल्सियस, 288,000 छ) भारी होते हैं, जो गैर-unilamellar पुटिकाओं गोली। नोट: अक्रिय गैस के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, तो पुटिकाओं कई महीनों के लिए बाईलेयर तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक SLB के गठन और प्रोटीन के साथ चार्ज 30 मिनट के लिए केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड का एक मिश्रण है और 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड: एक 3 के साथ 24 x 50 मिमी # 1.5 गिलास स्लाइड समझो। नोट: इस वीडियो में दिखाया गया है मिश्रण के आक्रामक स्वभाव के कारण विशेष ख्याल रखना है, यानी एक प्रयोगशाला कोट और सुरक्षा चश्मे पहनते हैं! एक धार बोतल से बाहर DDH 2 हे की एक धारा के तहत गिलास स्लाइड कुल्ला। एक Teflon स्टैंड पर उन्हें जगह और उन्हें सूखी10 से 30 मिनट के लिए। , 8 या 16 में अच्छी तरह से कक्षों के नीचे गिलास स्लाइड निकालें epoxy गोंद के साथ नीचे भरने के लिए और ध्यान से गोंद से ढके चैम्बर तल पर एक साफ और शुष्क गिलास स्लाइड जगह। लगभग 10 मिनट के लिए कड़ा गोंद करते हैं। नीचे से अतिरिक्त गोंद निकालें। नोट: कांच स्लाइड और कक्ष के बीच एक तंग सील भी आसानी से 10 से 30 मिनट के भीतर और मज़बूत बनाता है, जो एक दंत दो घटक सिलिकॉन मॉडलिंग का पेस्ट, के उपयोग से प्राप्त किया जा सकता है। यह मुहर epoxy गोंद के रूप में के रूप में फर्म नहीं है, लेकिन नियमित रूप से शारीरिक तनाव withstands। प्रयोग के बाद यह आसानी से भविष्य प्रयोगों में तो पुन: प्रयोज्य है जो चैम्बर से हटाया जा सकता है। एक 8 (16) के प्रत्येक कुएं में एक 10 गुना पीबीएस पतला लिपिड निलंबन की पिपेट 120 μl (60μl) – 20 मिनट के लिए दो और दो परतों का निर्माण (ऊपर वर्णित के रूप में तैयार) अच्छी तरह चैम्बर। ध्यान से 15 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार बाईलेयर कुल्ला। बाईलेयर का गठन किया है एक बार, यह हमेशा बफर में डूबे हुए किया जाना चाहिए और हवा के संपर्क में किया जा कभी नहीं। </ली> 330μl (8 अच्छी तरह चैम्बर) या 165μl (16-अच्छी तरह चैम्बर) से दूर ले तो, पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से सभी तरह से भरें। कुएं में छोड़ दिया 350μl (175μl) कर रहे हैं। प्रत्येक अच्छी तरह से (400 या 200 μl अंतिम) के लिए पीबीएस में पतला उनकी टैग प्रोटीन युक्त कॉकटेल की 50μl (25μl) जोड़ें और अंधेरे में 60 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। सतह प्रोटीन घनत्व इस ऊष्मायन चरण के दौरान प्रोटीन एकाग्रता अलग से समायोजित किया जा सकता है। 15 मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार कुल्ला। नोट: आमतौर पर, SLBs उनके प्रोटीन के साथ चार्ज के बाद अब 6 घंटा से प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस अवधि के दौरान, Photobleaching के बाद fluorophore वसूली 95% तक रहता है और bilayer जुड़े प्रोटीन में बिना किसी नुकसान का पता लगाया जा सकता है। प्रोटीन घनत्व (देखें नीचे) प्रयोग करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक कदम: SLB युक्त प्रोटीन डीजीएस NTA-नी की गैर विशिष्ट बंधन के लिए परीक्षण करने के लिए, पीबीएस 300 मिमी imidazole युक्त के साथ एक बार SLB धो लें। पेशेवरTein पूरी तरह से बंद आना चाहिए। 2. माइक्रोस्कोप सेटअप एकल fluorochromes की प्रतिदीप्ति पता लगाने में सक्षम एक माइक्रोस्कोपी प्रणाली के निर्माण के लिए परिचय में कहा गया है सिफारिशों को देखें। 3. बिजली की माप नोट: fluorophores आसानी से अतिरिक्त उत्तेजना प्रकाश के साथ संतृप्त किया जा सकता है। यह उत्सर्जन में आगे कोई लाभ के साथ photobleaching accelerates और इस प्रकार से बचा जाना चाहिए। उत्तेजना शक्ति घनत्व नमूना पर सीधे मापा जाना चाहिए नमूना रोशनी का अनुकूलन करने के लिए। इस तरह की माप भी भविष्य प्रयोगों के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा कर सकते हैं। प्रकाश इमेजिंग प्रणाली में खो जाता है, जहां का आकलन करते समय इसके अलावा, इनपुट और आउटपुट लेजर शक्ति के बीच का अनुपात जानने के लिए उपयोगी है। यह एक 90 डिग्री के कोण में उद्देश्य छोड़ देता है, ताकि ईमानदार स्थिति में उत्तेजना बीम ले जाएँ। शीर्ष ओ पर बिजली मीटर के सिर की जगहकिरण एफ और किरण (= पी) की शक्ति को मापने। परिणाम दस्तावेज़। पेरिस्कोप का उपयोग करना, TIRF स्थिति और छवि एक अक्षुण्ण समरूप फ्लोरोसेंट बाईलेयर में किरण की बारी है। एक तटस्थ घनत्व (एनडी) उत्तेजना प्रकाश पथ में 2 से 3 की एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) के साथ फिल्टर विरंजन और सीसीडी संकेत संतृप्ति जगह से बचने के लिए। पूरे प्रबुद्ध क्षेत्र के एकीकृत मायने रखता है (= मैं कुल) को मापने। इसके अलावा, प्रबुद्ध क्षेत्र (= एक कुल) के आकार को मापने। एकीकृत मायने रखता उपाय (= मैं केंद्र) ज़्यादा से ज़्यादा प्रबुद्ध केंद्र मौके के रूप में अच्छी तरह से स्थान के आकार (ए केंद्र =)। पिक्सेल प्रति पृष्ठभूमि संकेत उपाय (= बी) या तो प्रबुद्ध क्षेत्र के बाहर या नमूना रोशनी के बिना। 3. में मापा परिणाम) से पृष्ठभूमि संकेत घटाना। पृष्ठभूमि के साथ सवाल (पूरे प्रबुद्ध क्षेत्र या केंद्र स्थान) में क्षेत्र के पिक्सल की संख्या से गुणा करके यह मत करोपिक्सेल प्रति मायने रखता है। (- कुल ख और मैं केंद्र – = मैं कुल केंद्र ख)। फूट डालो और एकीकृत पृष्ठभूमि रोशनी के पूरे क्षेत्र के एकीकृत और पृष्ठभूमि सही संकेत से केंद्र स्थान का संकेत सही। नोट: परिणाम केंद्र स्थान (= (मैं केंद्र – एक केंद्र ख) / (मैं कुल – कुल ख)) के भीतर स्थित कुल बिजली का अंश इंगित करता है। प्रकाश केंद्र मौके रोशन की सत्ता में 2.) के परिणाम में मापा सत्ता पी के साथ इस परिणाम के गुणन। मौके μm² में एक केंद्र के आकार का निर्धारण। इस उद्देश्य की बढ़ाई द्वारा माइक्रोन में कैमरा पिक्सेल आकार को विभाजित के लिए, पिक्सेल प्रति μm² के रूप में परिणाम के वर्ग ले। वैकल्पिक रूप से माइक्रोस्कोप पर रखा एक माइक्रोमीटर स्लाइड के उपयोग के साथ छवि के भीतर पिक्सेल आकार को मापने और पिक्सेल प्रति क्षेत्र के रूप में परिणाम के वर्ग ले। Multiply केंद्र स्थान के भीतर स्थित पिक्सल की संख्या से इस मूल्य प्रबुद्ध स्थान क्षेत्र में आने के लिए। 2 माइक्रोन प्रति रोशनी की तीव्रता की गणना करने के μm², केंद्र जगह एक केंद्र के आकार के द्वारा केंद्र मौके रोशन सत्ता पी फूट डालो। एक उदाहरण चित्रा 6 में दी गई है। गैर TIRF रोशनी में मापा शक्ति घनत्व मूल्यों भी लेजर प्रकाश पूरी तरह से परिलक्षित होता है, जिस पर सटीक कोण पर निर्भर करती है जो TIRF रोशनी 13 में मौजूद उन लोगों की तुलना में आम तौर पर कम कर रहे हैं। TIRF रोशनी के तहत वर्तमान शक्ति घनत्व पर पहुंचने के लिए, छवि गैर TIRF और TIRF में दोनों 0.1μm व्यास की फ्लोरोसेंट मोती calibrated। TIRF और गैर TIRF मोड में मापा मनका प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात TIRF रोशनी (समीकरण 1) के तहत प्रभावी उन में मापा जाता शक्ति घनत्व मूल्यों के रूपांतरण की अनुमति देता है जो रूपांतरण कारक सी, के बराबर है। शक्ति घनत्व </eमीटर> TIRF = सी • ऊर्जा घनत्व गैर TIRF (समीकरण 1) सी के साथ = मनका तीव्रता टी आईआरएफ / मनका तीव्रता गैर TIRF 4. घनत्व माप एक bilayer पर स्थित व्यक्तिगत fluorophores की औसत संकेत निर्धारित करते हैं। फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स के साथ भरी हुई bilayer संलग्न एमएचसी अणुओं प्रोटीन के बाद से इस उद्देश्य के लिए आदर्श होते हैं: लेबल stoichiometry वास्तव में से एक है। आवश्यक ब्लीच सब देखने के क्षेत्र में bilayer पर लेबल और प्रतिदीप्ति एकल fluorophores कल्पना करने की वसूली करते हैं। तेजी से उत्तराधिकार में रिकॉर्ड छवियों (जैसे एक स्ट्रीमिंग अधिग्रहण प्रोटोकॉल लागू) और कई तख्ते पर एकल अणुओं गतिशीलता की निगरानी। अधिक जानकारी के लिए 7 चित्रा को देखें। <lमैं> मार्क रॉय के रूप में दो परतों के भीतर केंद्रीय रोशनी हाजिर। रॉय के उपाय, (प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए आनुपातिक है), जो रोशनी ऊर्जा घनत्व में विचरण 15% की तुलना में आदर्श कम होना चाहिए। केवल इस रॉय के भीतर एक अणु और थोक प्रतिदीप्ति का निर्धारण करते हैं। एक emitter की बात फैल समारोह का 99% या उससे अधिक पर कब्जा करने के लिए काफी बड़ी है, जो एक रॉय के संकेत एकीकृत। 16-20 माइक्रोन के एक पिक्सेल आकार के साथ एक कैमरा रोजगार जब 100 गुना बढ़ाई और बराबर या 1.45 से बड़ा एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य के साथ 7 पिक्सल द्वारा 7 के एक क्षेत्र ले, (निर्माता के कैमरे विशिष्टताओं में कहा गया है) वर्ग के केंद्र में स्थित तीव्रता शिखर। पृष्ठभूमि संकेत निर्धारित करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति संकेत शामिल नहीं है जो एक पड़ोसी 7 7 से पिक्सेल वर्ग के मायने रखता है एकीकृत। एक अणु स्त्राव के लिए सही मूल्य निर्धारित करने के लिए एक अणु के संकेत से पृष्ठभूमि घटानाescence। अभी भी निम्न फ्रेम में दिखाई दे रहे हैं जो केवल संकेत है, का चयन करें। कई सौ गुना तक दोहराएँ कदम 4.2 पचास। पृष्ठभूमि को सही संकेत औसत। अगर वांछित, एक हिस्टोग्राम के रूप में एक अणु तीव्रता मूल्यों साजिश है। वैकल्पिक: खुला स्रोत सॉफ्टवेयर संकुल का एक उपयुक्त प्लगइन (जैसे ImageJ) का लाभ लेने के लिए या वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (जैसे Metamorph, आण्विक उपकरण) का उपयोग कर डेटा की प्रक्रिया। अनुभवी उपयोगकर्ताओं को मैटलैब या इसी तरह के सॉफ्टवेयर संकुल में अपने स्वयं के विश्लेषण प्रोग्राम लिख सकते हैं। उत्तेजना पथ में 2 या अधिक की एक तटस्थ घनत्व फिल्टर की जगह और एक ही fluorophore साथ लेबल प्रोटीन युक्त एक फ्लोरोसेंट bilayer के चित्र लेने। एक अणु तीव्रता माप के लिए इस्तेमाल एक ही रॉय के भीतर औसत पिक्सेल तीव्रता रिकॉर्ड। थोक प्रतिदीप्ति माप का जोखिम समय रिकॉर्ड। पृष्ठभूमि घटाव के लिए रोशनी के बिना एक ही स्थान उपाय। द्वि भीतर प्रोटीन घनत्व निर्धारित करने के लिएपरत, वर्ग माइक्रोन प्रति पिक्सल (जैसे 41.5), 100 (2 के एक आयुध डिपो के साथ एक एन डी फिल्टर नियुक्त किया गया था तो) या 1,000 की संख्या (यदि द्वारा चरण 4 में निर्धारित पृष्ठभूमि को सही थोक प्रतिदीप्ति औसत पिक्सेल तीव्रता गुणा एक ND 3 के एक आयुध डिपो के साथ फिल्टर का इस्तेमाल किया गया था) और जोखिम समय चरण 2 में इस्तेमाल किया और चरण 3 में निर्धारित औसत एक अणु के संकेत से विभाजित, जोखिम समय चरण 2 में इस्तेमाल किया और प्रोटीन प्रति fluorophores की संख्या। 5. परीक्षण bilayer के वफ़ादारी एक फ्लोरोसेंट बाईलेयर को तैयार है और जैसा कि ऊपर वर्णित खुर्दबीन मंच पर जगह है। ध्यान समायोजित और TIRF मोड में bilayer की एक छवि ले। एक छोटे डिस्क के आकार रॉय के भीतर प्रतिदीप्ति काटकर अलग करने के लिए गैर-TIRF मोड में एक छोटे लेकिन तीव्र ब्लीच पल्स लागू करें। तुरंत विरंजन के बाद कम तीव्रता TIRF मोड में bilayer की एक छवि ले लो और फिर हर पांच सेकंड से दस प्रतिदीप्ति वसूली की गति पर नजर रखने के लिए। मोbilayer पर एक अलग क्षेत्र के लिए किया है और चरण 2 और 3 ब्लीच नाड़ी के बाद कम तीव्रता TIRF मोड में 5 मिनट के लिए एक और छवि ले लो का पालन करें। मैं ब्लीच क्षेत्र में ब्लीच पोस्ट और इस प्रकार (यदि) स्थिर अंश की गणना करने के लिए (कोई विरंजन हुआ है चाहिए) प्रयोग की शुरुआत में मैं 0 विरंजन करने से पहले तीव्रता के लिए यह तुलना तीव्रता का निर्धारण: स्थिर अंश (%) = (मैं 0 – मैं ब्लीच पोस्ट) / (मैं 0 – पृष्ठभूमि), 100 x पृष्ठभूमि के साथ = नहीं उत्तेजना प्रकाश के साथ रॉय के भीतर मापा तीव्रता से लागू किया अगर कम से कम 10% (आदर्श कम से कम 5%) होना चाहिए।

Representative Results

एक अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सिस्टम के आर्किटेक्चर चित्रा 2 में काफी विस्तार से रेखांकित किया गया है। इस तरह के ऑप्टिकल घटकों और अन्य हार्डवेयर घटकों के रूप में अलग अलग हिस्सों शुरूआत में समझाया जाता है। TIRF और गैर TIRF रोशनी करने के लिए एक निर्धारित तरीके से जन्म दे, जो ऑप्टिकल उत्तेजना किरण पथ, दिखाया गया है और 5 के लिए 3 आंकड़े में समझाया जाता है। पर तैनात पहले पेरिस्कोप आईने के सामने 50:50 बीम फाड़नेवाला की स्थिति पर ध्यान दें एक माइक्रोमीटर से अनुवाद चरण (चित्रा 5)। यह बीम फाड़नेवाला (हरे रंग में संकेत दिया) इमेजिंग के लिए इस्तेमाल TIRF बीम और (लाल रंग में संकेत दिया) गैर TIRF किरण (चित्रा 3 में उल्लिखित) विरंजन या स्थानीय एपर्चर से परिभाषित प्रकाश की मध्यस्थता नमूना सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया superimposes। (नारंगी में संकेत चित्रा 5), संयुक्त प्रकाश रास्तों उल्टे माइकर के पीछे पोर्ट में दूसरे पेरिस्कोप दर्पण के माध्यम से परिलक्षित होते हैंoscope। चित्रा 4 में विस्तार से बताया और चित्रा 2 में उल्लिखित है, दो या तीन उत्तल लेंस के कार्यान्वयन लेजर बीम प्रोफाइल चौड़ी और TIRF में नमूना रोशन दो collimated मुस्कराते हुए को जन्म देने के लिए उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर लेजर बीम ध्यान केंद्रित है और , क्रमशः, गैर TIRF में। नमूना पर ऊर्जा घनत्व की गणना के लिए आवश्यक मापा तीव्रता मूल्यों के लिए एक उदाहरण चित्रा 6 में दिखाया गया है। औसत पृष्ठभूमि संकेत (इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता) प्रबुद्ध और मध्य क्षेत्र में मापा तीव्रता से घटाया जाना है, के भीतर एक क्षेत्र में चुना गया है लेजर बीम (यहाँ 7089 में गिना जाता है) द्वारा प्रकाशित नहीं किया गया है जो देखने के लिए, के क्षेत्र। प्रबुद्ध (1684 मायने रखता है) की पृष्ठभूमि को सही औसत तीव्रता और केंद्रीय क्षेत्र (4830 मायने रखता है) तो एकीकृत तीव्रता को जन्म (1.471 देने के लिए इसी क्षेत्र आकार से गुणा कर रहेप्रबुद्ध क्षेत्र के लिए 10 x 8 मायने रखता है और मध्य क्षेत्र के लिए 3.424 10 x 7 मायने रखता है)। केंद्रीय और प्रबुद्ध क्षेत्रों के भीतर एकीकृत तीव्रता के अनुपात केंद्रीय क्षेत्र (0.23 या 23%) रोशन समग्र शक्ति के अंश अर्जित करता है। फिल्म में दिखाया गया है, कुल बिजली की गैर TIRF रोशनी मोड में एक बिजली मीटर के उपयोग के साथ उद्देश्य से निर्धारित किया गया है। हमारे उदाहरण में यह इस प्रकार मध्य क्षेत्र के भीतर 5 मेगावाट एक्स 0.23 = 1.15 मेगावाट की बिजली को जन्म दे रही है, 5 मेगावाट निकाला जाता है। 1 माइक्रोन से 2 हमारे उदाहरण में 41.5 पिक्सल राशि के बाद से, केंद्रीय क्षेत्र 7089 पिक्सल /41.5 पिक्सल x माइक्रोन 2 = 170.8 माइक्रोन 2 का एक आकार है। इस क्षेत्र (170.8 माइक्रोन 2) द्वारा केंद्रीय क्षेत्र (1.15 मेगावाट) रोशन प्रकाश की शक्ति डिवाइडिंग औसत बिजली की पैदावारकेंद्रीय क्षेत्र के भीतर 0.7 किलोवाट / 2 सेमी के घनत्व। चित्रा 7 छवियों और तेजी से उत्तराधिकार में प्राप्त कर लिया एकल fluorophores की इसी तीव्रता परिणाम (10 मिसे की एक समय सीमा के साथ यानी प्रति सेकंड 100 फ्रेम) की सुविधा है। तीव्रता quantitation के लिए प्रतिदीप्ति संकेत को शामिल किया गया है, जो सात (= 49) पिक्सल, से सात वर्ष की एक आयताकार क्षेत्र की औसत संकेत निर्धारित किया जाता है। इसके अलावा पृष्ठभूमि की औसत संकेत एक अणु के संकेत के करीब निकटता में सात पिक्सल द्वारा सात वर्ष की एक आयताकार क्षेत्र के भीतर निर्धारित किया जाता है। पृष्ठभूमि को सही औसत संकेत (बोल्ड में चिह्नित) एक अणु के संकेत को जन्म देने के लिए क्षेत्र (= 49) के भीतर पिक्सल की संख्या से गुणा किया जाता है। SLB जुड़े प्रतिदीप्ति लेबल प्रोटीन की गतिशीलता का आकलन करने के लिए बनाया गया एक प्रतिनिधि FRAP प्रयोग 8 चित्रा में दिखाया गया है। चित्रा 8A repeti में नोटएक चौड़ी कम तीव्रता इमेजिंग किरण और अधिक संकीर्ण और एक दूसरे का एकल उपयोग के सक्रिय उपयोग शून्य दूसरी बार बिंदु पर तेजी से fluorochrome पृथक के लिए उच्च तीव्रता बीम एपर्चर परिभाषित किया। ब्लीच नाड़ी करने से पहले प्रारंभिक औसत तीव्रता मूल्य द्वारा सामान्यीकृत किया गया है, जो पीले सर्कल के भीतर पृष्ठभूमि घटाया औसत तीव्रता, गति और किस हद तक प्रतिदीप्ति बरामद किया है को रिकॉर्ड करने के लिए समय के खिलाफ चित्रा 8B में प्लॉट किए जाते हैं। दिखाया गया है, प्रारंभिक बाईलेयर तीव्रता का (ग्रीन लाइन द्वारा इंगित) 90% से अधिक fluorochrome पृथक निम्नलिखित 75 सेकंड के भीतर बरामद किया है। एक परिणाम के रूप में दिखाया गया SLB में एम्बेडेड प्रोटीन के 10% से कम स्थिर हैं। एक SLB प्रणाली के 1. योजनाबद्ध रूपरेखा चित्रा। (ए) SLBs POPC (90-99%) और सिंथेटिक लिपिड डीजीएस NTA-एन के बने होते हैंमैं (1-10%)। साफ कांच सतहों इसी लिपिड से मिलकर एसयूवी के साथ लिया जाता है जब वे अनायास रूप में। (बी) एक बार का गठन, इन SLBs आसानी से या तो एक सी या (12H बारह histidines युक्त एन टर्मिनल टैग, के लिए के साथ बढ़ाया घुलनशील प्रोटीन के साथ सजाया जा सकता है उदाहरण के सह-उत्तेजक अणु B7-1 और आसंजन अणु ICAM-1) या प्रोटीन dimers दो टैग उदाहरण एक αβMHC वर्ग द्वितीय डिमर)। के लिए, प्रत्येक (2x6H छह histidines युक्त साथ बढ़ाया इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा। चित्रा 2. उत्तेजना और उत्सर्जन किरण पथ का अवलोकन। गैस आयन लेजर (जैसे अर + या केआर +) acousto ऑप्टिकल मो के उपयोग के साथ तेजी से बंद करने के लिए संचालित किया जा सकता है dulators। लेजर डायोड कई तरंग दैर्ध्य में आजकल उपलब्ध हैं और वे इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोसैकेण्ड-क्रोध में संग्राहक जा सकता है के रूप में एक बेहतरीन विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं। लेजर बीम को आसानी से दो (dichroic) दर्पण और विभाजन के साथ समायोजित किया और दो या अधिक किरण पथ को जन्म देने के लिए सरल बीम splitters के उपयोग के साथ जोड़ा जा सकता है कि ध्यान दें। इस उदाहरण में एक TIRF इमेजिंग किरण (घटनाओं पर नजर रखने के लिए) और एक ब्लीच किरण (ब्लीच fluorophores या तो तस्वीर सक्रिय एक छेद से परिभाषित तरीके से बंदी अणुओं) का इस्तेमाल किया जाता है। दोनों उत्तेजना रास्तों अतिरिक्त दरवाज़े के उपयोग के माध्यम से एक दूसरे से स्वतंत्र रूप से संचालित किया जा सकता है। पेरिस्कोप नमूने की TIRF रोशनी उत्पन्न करने के उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के भीतर केंद्रित लेजर बीम का अनुवाद करने के लिए अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट छवि प्रेतसंबंधी एक अति संवेदनशील कैमरा (जैसे ईएम सीसीडी या वैज्ञानिक CMOS कैमरा) के उपयोग के साथ अधिग्रहण करने से पहले एक उत्सर्जन बीम फाड़नेवाला के उपयोग के साथ विभाजित किया जा सकता है।com / फ़ाइलें / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3. उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के भीतर केंद्रित बीम का अनुवाद करके TIRF रोशनी समायोजन। लेजर बीम का केन्द्र बिन्दु के रूप में दिखाया किरण की translocation के माध्यम से परिधि के लिए केंद्र से उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के भीतर स्थानांतरित कर दिया है (एक पेरिस्कोप दर्पण व्यवस्था का उपयोग)। एक महत्वपूर्ण कोण कुल आंतरिक प्रतिबिंब होता है, जिस पर पहुँच जाता है जब तक एक परिणाम के रूप में एक समानांतर बीम एक झुका रोशनी में उद्देश्य छोड़ देता है। क्षणभंगुर क्षेत्र की कुल प्रतिबिंब होता है, जहां कांच मीडिया इंटरफेस में उत्पन्न होता है। इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें Gure। चित्रा 4. सरल ऑप्टिकल प्रणाली उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ में लेजर बीम ध्यान केंद्रित करने के लिए। तीन या दो लेंस लेजर बीम को चौड़ा करने और TIRF उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है। दो लेंस प्रणाली तीन लेंस प्रणालियों की तुलना में कम लेंस से जुड़े त्रुटियों के होते हैं और TIRF इमेजिंग किरण पैदा करने के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है। परिभाषित बीम को चौड़ा करने और तेज किनारों के साथ एक रोशनी स्थान के लिए लक्ष्य जब फोटो सक्रियण या -bleaching रोजगार के अध्ययन के लिए आवश्यक होगा के रूप में तीन लेंस, बेहतर हो सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। /53158fig5.jpg "/> चित्रा 5. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की पीठ पर किरण पथ की तस्वीर एनोटेट। पहले से ही आसानी से दो उत्तेजना मुस्कराते हुए, TIRF में एक (हरे रंग में संकेत दिया) गैर TIRF मोड में अन्य लागू चित्रा 2 एक गन्ने में उल्लिखित है (जैसा कि में संकेत लाल)। ये 50:50 बीम फाड़नेवाला (बी एस) के उपयोग के साथ मढ़ा हो जाते हैं। उत्तल लेंस (एल 1 और एल 2) उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर उन्हें ध्यान केंद्रित करने के लिए संबंधित कड़ियां में तैनात कर रहे हैं () नहीं दिखाया। दो दर्पण (एम 1 और एम 2) से मिलकर एक पेरिस्कोप माइक्रोस्कोप में प्रवेश के बंदरगाह के माध्यम से दोनों मुस्कराते हुए मार्गदर्शन करता है। पहले दर्पण (एम 1) TIRF स्थिति में मुस्कराते हुए एक स्थानांतरित करने के लिए (संकेत के रूप में एक माइक्रोमीटर पेंच बदल कर) एक अनुवाद चरण (टीएस) के उपयोग के साथ ले जाया जा सकता है। TIRF स्थापित किया गया है, यहाँ (लाल रंग में संकेत दिया तस्वीर विरंजन या -activation, के लिए प्रयोग किया जाता) दूसरे किरण गैर TIRF में उद्देश्य छोड़ने के लिए स्वतंत्र रूप से TIRF बीम के समायोजित किया जा सकतामोड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। रोशनी स्थान के मध्य क्षेत्र के भीतर शक्ति को मापने चित्रा 6। पृष्ठभूमि को प्रतिबिंबित जो ब्याज की उचित क्षेत्रों चुना संकेत दिया है के रूप में, पूरे प्रबुद्ध क्षेत्र (आइए) और घटनाओं बाद में दर्ज किया जाएगा, जहां केंद्रीय क्षेत्र (सीए),। आइए और सीए के लिए दर्ज की गई है उन लोगों से पृष्ठभूमि मूल्यों को घटाना और प्रत्येक क्षेत्र (= एकीकृत तीव्रता) के भीतर मौजूद पिक्सेल की संख्या के साथ ठीक औसत तीव्रता गुणा करके तीव्रता एकीकृत। (: 23% इस उदाहरण में) सीए रोशन बीम सत्ता के अनुपात पर पहुंचने के लिए आइए की है कि द्वारा सीए के एकीकृत तीव्रता फूट डालो। यहां समग्र बीम शक्ति (गुणा करके सीए रोशन प्रकाश की शक्ति का निर्धारण: 5 मीटर0.23): यहां सीए (रोशन अनुपात के साथ डब्ल्यू)। (1 / 41.5 माइक्रोन 2 पिक्सेल -1 यहाँ) एक पिक्सेल करने वाली क्षेत्र आकार रूपांतरण कारक के साथ: (7089 पिक्सेल यहाँ) क्षेत्र गुणा केंद्रीय क्षेत्र के आकार का निर्धारण करने के लिए। सीए के आकार से: (1.15 मेगावाट यहाँ) शक्ति विभाजित, सीए रोशन उत्तेजना प्रकाश की औसत ऊर्जा घनत्व में आने के लिए। (यहाँ: 170.8 माइक्रोन 2) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। एक अणु संकेतों के 7 चित्रा quantitation। (ए) एक SLB पर एकल fluorophores के समय पाठ्यक्रम। ब्याज (आरओआई, पीला) की एक 7 एक्स 7 पिक्सेल आकार क्षेत्र quantitation के लिए संकेत के आसपास रखा है। पृष्ठभूमि एक पड़ोसी 7 एक्स 7 पिक्सेल से निर्धारित किया जाता हैआरओआई (हरा)। (बी) की मात्रा निर्धारित की औसत पिक्सेल तीव्रता सूचीबद्ध हैं। एक अणु संकेत निर्धारित करने के लिए, पृष्ठभूमि मूल्यों (हरी आरओआई) एक की fluorophore एक अणु तीव्रता समय के खिलाफ साजिश रची है संकेत मूल्यों (पीला आरओआई) से घटाया और 49 (सी) से गुणा कर रहे हैं। Fluorophore विरंजन की प्रक्रिया में है के रूप में 90 मिसे समय बिंदु को छोड़ा जाता है कि, ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। SLB की अखंडता को निर्धारित करने के लिए (FRAP) के विश्लेषण Photobleaching के बाद 8. प्रतिदीप्ति वसूली चित्रा। (ए) FRAP प्रयोग की हर 10 वीं की छवि में दिखाया गया है IEK / एमसीसी-एलेक्सा स्त्राव 647. ले जाने के एक bilayer पर प्रदर्शन किया गया था। में दिखाया प्रयोग (बी) FRAP quantitation (ए)। मूल्यों विरंजन से पहले प्रारंभिक तीव्रता (मैं ओ) द्वारा विभाजित (ए) में दिखाया गया है पीला रॉय के भीतर औसत तीव्रता (मैं) से संकेत मिलता है। रेड डाटा अंक (ए) में प्रदर्शित कर रहे हैं, हरे रंग की लाइन मूल तीव्रता 0.9 वसूली को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एक अणु माइक्रोस्कोपी उनके पैतृक सेलुलर पर्यावरण के भीतर प्रोटीन के व्यवहार का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। आण्विक इमेजिंग एक व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए इसलिए तेजी से आकर्षक हो जाता है, फिर भी कई जीवन वैज्ञानिकों को अब भी दूर प्रौद्योगिकी और विशेषज्ञता में प्रारंभिक निवेश से दूर भागते हैं। एक के अपने इमेजिंग प्रणाली कोडांतरण से उत्पन्न होने वाली मुख्य लाभ यह है कि आसानी से किसी के भी विशिष्ट जरूरत को समायोजित किया जा सकता है।

इस के साथ साथ सुझाव के रूप में एक गैर TIRF उत्तेजना बीम आसानी से एक मौजूदा TIRF प्रकाश पथ के अलावा लागू किया जा सकता है, fluorophores और ligands के तेजी से और परिभाषित तस्वीर विरंजन (या -activation) वांछित है, जैसे जब प्रदर्शन FRAP या ligand uncaging के प्रयोगों ¹⁴ । एक उत्सर्जन बीम फाड़नेवाला की शुरूआत के कम से कम दो के साथ रिकॉर्डिंग के लिए और चार फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए कुछ मामलों में अनुमति देता है। एक्सटेंशन की सूची केवल द्वारा सीमित सार में हैएक की अपनी कल्पना।

उदाहरण के लिए, उत्सर्जन रास्ते में एक मोटर चालित उत्सर्जन फिल्टर पहिया लागू करने अप करने के लिए दस अलग फ्लोरोसेंट चैनलों के बीच तेजी से बदलने के लिए अनुमति देता है। दो मोटर उत्सर्जन फिल्टर पहियों के संयोजन जब 18 फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए बाहर पढ़ा जा सकता है, इस श्रृंखला में (प्रत्येक 10 फिल्टर स्लॉट के साथ सुसज्जित)। TIRF इमेजिंग आधारित कैल्शियम लामबंदी माप और एक क्सीनन या बुध उत्तेजना दीपक पथ के एकीकरण के बाद हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) के साथ पूरक हो सकते हैं। आईआरएम कोशिकाओं कांच की सतह या एक SLB से जुड़े होते हैं और TIRF आधारित इमेजिंग डेटा की व्याख्या जब इसलिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं जो करने के लिए डिग्री कल्पना करने के लिए पसंद की विधि है। एक साधारण dichroic दर्पण के उपयोग और photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) या स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) का आयोजन अनुमति देता है एनएम 405 का एक अतिरिक्त लेजर, यानी दो superresolut साथ एक चौड़ी उत्तेजना बीम की स्थापनादृश्य प्रकाश ^15,16 के विवर्तन सीमा से नीचे एक स्थितीय सटीकता के साथ आयन के तरीके।

हालांकि, प्रयोगात्मक सफलता न केवल उचित हार्डवेयर का एक मामला है। शोर कम TIRF आधारित इमेजिंग का पूरा फायदा उठाने के लिए, कोशिकाओं कोशिका की सतह पर बाधाओं लागू या कि उनकी प्लाज्मा झिल्ली के शरीर क्रिया विज्ञान के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक फैशन में एक सतह के लिए संपर्क करना चाहिए। SLBs सभी SLB-एम्बेडेड ligands के पहलू के बल मोबाइल हैं और बाध्यकारी और अलगाव की गतिशीलता रिसेप्टर के जवाब में bilayer के भीतर अपने पार्श्व स्थिति को समायोजित क्योंकि कोशिका आसंजन के लिए उचित प्रोटीन इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से अनुकूल अधिक कर रहे हैं के साथ क्रियाशील।

एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन में SLBs का निर्माण करने के लिए, यह उच्च शुद्धता की एसयूवी के साथ बाहर शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है। इस के साथ साथ वर्णित है, यह इन मैं के रूप में दो ultracentrifugation के चरणों में भी sonication के दौरान उत्पादन किया जाता है, जो multilamellar पुटिकाओं, दूर करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण हैउच्च तरलता की विशेषता सन्निहित SLBs के गठन के साथ nterfere। केवल साफ कांच सतहों पर उच्च गुणवत्ता वाले फार्म की SLBs। एक बार साफ गिलास स्लाइड तुरंत इस्तेमाल किया या शून्य में संग्रहित किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात है, SLBs उनके विघटन करने के लिए नेतृत्व करेंगे इस के रूप में हवा के संपर्क में किया जा कभी नहीं करना चाहिए। SLB धोने यह एक बचा है लेकिन यह भी समय की बचत प्रक्रिया ही नहीं है, के रूप में बफर एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के उपयोग के साथ rinsing, के रूप में दिखाया, शामिल है।

SLB-निवासी प्रोटीन की कटाई और शुद्धि के दौरान डिटर्जेंट के उपयोग से बचना चाहिए। इस डिटर्जेंट भी जब वर्तमान मात्रा का पता लगाने में काफी प्रोटीन गतिशीलता कम हो जाएगा क्योंकि है। सब एक साथ डिटर्जेंट के लिए की जरूरत को नाकाम करने के लिए, स्रावित polyhistidine टैग सुसज्जित ligands के घुलनशील अभिव्यक्ति स्तनधारी या कीट कोशिकाओं में सिफारिश की है। कोलाई समावेश शरीर से refolding की आवश्यकता है, सावधानी उनकी संयुक्त राष्ट्र और refolding करने से पहले समावेश शरीर से प्रभावी ढंग से डिटर्जेंट दूर करने के लिए लागू किया जाना चाहिए।

विशेष सेल सक्रियण और कोशिका आसंजन के लिए एक दिया रिसेप्टर ligand बातचीत की भूमिका काटना करने के लिए अनुमति देता है जो उनके मॉड्यूलर और reconstitutive प्रकृति से SLBs परिणाम रोजगार का एक बड़ा फायदा। इस संबंध में यह डीजीएस NTA-नी NTA-एनआई बाध्यकारी साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा प्रोटीन को रोकने के क्रम में SLB के भीतर 10% पर मौजूद होना चाहिए कि उल्लेख करना महत्वपूर्ण है। केवल 1% या 2% डीजीएस NTA-नी, एक दिया polyhistidine टैग प्रोटीन प्रजातियों के सहयोग में कमी को शरण देने SLBs रोजगार जब अप्रकाशित (विशेष रूप से एक दूसरे polyhistidine टैग प्रोटीन प्रजातियों की बढ़ती मात्रा के सह-incubating जब देखा जा सकता है अवलोकन)। 10% डीजीएस NTA-नी विशेषता SLBs के साथ काम करते हैं तो यह घटना नहीं मनाया जाता है।

हम महानिदेशकों NTA-नी युक्त SLBs करने के लिए परीक्षण किसी भी polyhistidine टैग प्रोटीन के बंधन गैर विशिष्ट कभी नहीं देखा है, जबकि पहली बार के लिए एक प्रोटीन को शुरू करते हैं, तो इस संभावना परीक्षण किया जाना चाहिए,यह अंत करने के लिए हम महानिदेशकों NTA-नी (प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं होना चाहिए) से रहित SLBs के इस्तेमाल की सिफारिश। डीजीएस NTA-नी युक्त एक SLB का उपयोग करते समय दूसरे, प्रोटीन पीबीएस 300 मिमी imidazole युक्त साथ SLB धोने के बाद पूरी तरह से बंद आना चाहिए।

SLBs रोजगार का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ क्षणिक बातचीत और संकेत घटनाओं बढ़ाया spatiotemporal संकल्प ^17-19 से नजर रखी जा सकती है। एक तीन आयामी बाध्यकारी प्रक्रिया अनिवार्य रूप से विशेष रूप से शोर-तनु TIRF मोड में जब रिकॉर्डिंग, दो इमेजिंग आयाम के लिए कम है क्योंकि इस हिस्से में कम से कम है। SLBs के उपयोग के एक अणु संकेत का पता लगाने, फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) या स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के लिए एक शर्त है, विवर्तन सीमा ^15,16 के नीचे एक संकल्प के साथ यानी superresolution माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है। इन विशेष रूपरेखा इमेजिंग एक अणु Forster अनुनाद ऊर्जा ट्रा सक्षमnsfer प्रयोगों एक synaptic वातावरण ²⁰ में अलग-अलग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत कल्पना करने के लिए बनाया गया है। यह दृष्टिकोण "मापने TCR-pMHC एक झल्लाहट आधारित माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग बाध्यकारी" ²¹ करार दिया एक जौव प्रकाशन में काफी विस्तार से समझाया गया है।

SLB आधारित प्रयोगों की व्याख्या करते समय एक हमेशा एक जीवित कोशिका का एक प्लाज्मा झिल्ली के सभी गुण SLBs द्वारा चित्रित कर रहे हैं कि दिमाग में रखना चाहिए, और लापता गुणों में से कुछ को जांच के तहत शरीर विज्ञान को प्रभावित कर सकता है। सब के बाद, SLB-एम्बेडेड प्रोटीन स्वतंत्र रूप से diffusing और उनके सेलुलर समकक्षों के सबसे ^5,6,22 के रूप में झिल्ली microdomains में संगठित नहीं हैं। कुछ हद तक जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली वास्तुकला के संरक्षण के जो पक्षपाती कोशिकाओं से प्राप्त स्थिर प्लाज्मा झिल्ली चादरें, सफलतापूर्वक बी लिम्फोसाइटों ²³ से झिल्ली एम्बेडेड एंटीजन से तेज अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, यहां तक ​​कि इस तरह केझिल्ली एक अत्यंत गतिशील cytoskeleton के साथ बातचीत और वे एक कठोर कांच की सतह से समर्थन कर रहे हैं के रूप में कोई लचीलापन सुविधा नहीं है। इन विसंगतियों को ध्यान में रखते समायोज्य लचीलापन की सतहों से या स्थानीय रूप से लागू प्रकाश दालों के जवाब में उनकी कठोरता बदलने जो सतहों द्वारा समर्थन कर रहे हैं एक परिभाषित फैशन में प्रोटीन compartmentalize का मतलब है और जो जो इंजीनियरिंग SLBs, के लिए एक की जरूरत स्पष्ट रूप से नहीं है।

Materials

#1.5 glass slides	VWR	631-0853
250ml round bottom flask	VWR	201-1357
50:50 beam splitter cubes	Thorlabs	BS013
Acousto-opitcal modulator C1205-2	Isomet	–	only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used
Alexa Fluor 488-NHS	Life technologies	A-20000
Alexa Fluor 555-NHS	Life technologies	A-20009
Alexa Fluor 647-NHS	Life technologies	A-20006
autoclave tape	VWR	489-1312	or any other heat-stable sticky tabe
Avanti Mini-Extruder	Avanti Lipids	610000	alternative to the bath sonicator
bath sonicator QSONICA Q700	QSONICA	Q700
beam splitter	Cairn	P280/210/MLS
Büchi rotary evaporator	VWR	531-0837
camera	Andor	iXon Ultra 897	see manuscript text for alternatives
concentarted hydrogenperoxide	Roth	9683.1
concentrated sulfuric acid	Roth	X944.2
epoxy glue	Uhu	45705	Uhu plus sofortfest 2min
filter wheel	Sutter instruments	Lambda 10-2
LabTek chambers	VWR	734-2062
laser	Toptica	–	different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available
lens	Thorlabs, Newport	–
DGS NTA-Ni (lipid)	Avanti Lipids	790404C	already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended
POPC (lipid)	Avanti Lipids	850457C	already in Choroform-solved delivered version is recommended
microscope Zeiss Axiovert 200	Zeiss	–
mirrors	Thorlabs	BB1-E02
optical filters	AHF, Chroma, Semrock	–	filter sets are available for many different combinations of dyes
oscilloscope	BK Precision	2120C
phosphate buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	degas before usage
periscope	Thorlabs	RS99/M
picodent twinsil 22	Picodent	13001000	alternative to the epoxy glue
power meter Lasermate-Q	Coherent	–	any powermeter sensitive in the used spectral range will do
pulse generator	Stanford Research Systems	SRS DG535
spatial filter	Thorlabs	KT310/M
syringe filter 0.2µm	Millipore	GVWP04700
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46	Zeiss	440782-9800-000
trichloromethane/chloroform	Roth	3313.1
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm	Thermo Fisher	45237
Sorvall ultracentrifuge	Thermo Fisher	RC M150GX
ultracentrifuge rotor	Thermo Fisher	S120-AT2
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c	Thermo Fisher	–
vacuum pump	VWR	181-0248