Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
कार्रवाई के अपने मोड अक्सर पारंपरिक जैव रासायनिक तरीके से पता लगाने और मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल हो जाता है, जो कम आत्मीयता बातचीत, द्वारा परिभाषित कर रहे हैं क्योंकि झिल्ली प्रोटीन उनके सेलुलर कार्य को पूरा तंत्र है जिसके द्वारा समझ अक्सर, एक चुनौतीपूर्ण काम हो सकता है। झिल्ली प्रोटीन इसके अलावा अत्यधिक सिद्धांत रूप में उनके जैविक गतिविधि 7 को बदल सकता है, जो विशिष्ट झिल्ली डोमेन 5,6 या गतिशील उच्च आदेश संरचनाओं फार्म में समृद्ध बनाया जा सकता है।
गैर इनवेसिव लेजर की सहायता एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इस प्रकार जटिल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकल्प की पद्धति बन गया है। इन सिद्धांत में शोर कम कुल आंतरिक परावर्तन (TIRF) मोड में नजर रखी जा सकती है, क्योंकि यह विशेष रूप से प्लाज्मा झिल्ली में जगह लेने के जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के लिए सच है। यहाँ नमूना रोशनी एक गिलास सु पास में 200 एनएम पतली टुकड़ा करने के लिए एक अप करने के लिए प्रतिबंधित हैयह भी प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता 8,9 में पर्याप्त वृद्धि के कारण, क्षणभंगुर उत्तेजना प्रकाश की विशेषताओं के लिए, सेलुलर पृष्ठभूमि में एक महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम है और जो rface। एक अणु का पता लगाने में उच्च स्थितीय और अस्थायी समाधान के लिए लक्ष्य जब दोनों पहलुओं से महत्वपूर्ण हैं।
तलीय SLBs TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ ही संगत नहीं हैं। उचित ligands के साथ क्रियाशील जब वे भी वे प्रतिरक्षा कोशिकाओं या अन्य कोशिकाओं में पाए जाते हैं के रूप में सेल सेल मान्यता की आणविक गतिशीलता के अध्ययन के लिए सीधी पहुँच प्रदान करते हैं। उन्होंने यह भी बस ऐसी कोशिकाओं अति आवश्यक है जो TIRF रोशनी में imaged किया जा सकता है, ताकि कांच स्लाइड के लिए काफी करीब गतिशील और अन्यथा गैर पक्षपाती कोशिकाओं की स्थिति के लिए उपयोग किया जा सकता है, जब एक अणु ट्रैकिंग या एक अणु-आधारित superresolution शामिल चालन प्रयोगों। यह अंत करने के लिए प्रोटीन एक अत्यधिक मोबाइल SLB पर लोड किया जाना है। इस्तेमाल किया ली का एक अंतर्निहित लाभ पीआईडी पर सभी प्रोटीन का कोई unspecific बाध्यकारी है कि वहाँ रहे हैं। इसके अलावा, SLBs खुद को चंगा करने के लिए एक अंतर्निहित क्षमता के साथ दो आयामी तरल पदार्थ के रूप में माना जा सकता है; कांच समर्थन के भीतर अनियमितताओं एक निश्चित डिग्री करने के लिए मुआवजा दिया जाता है। एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल हित के प्रोटीन के साथ आरोप लगाया अत्यधिक मोबाइल bilayers उत्पन्न करने के लिए प्रदान की जाती है। तलीय SLBs के गठन के मुख्य घटक (90-99%) और सिंथेटिक के रूप में एक-palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन.-ग्लिसरो-3-phosphocholine (POPC) होते हैं, जो वर्णित है और लिपिड 1,2-dioleoyl- क्रियाशील है एस.एन. -glycero-3 – {[एन (5-अमीनो-1-carboxypentyl) iminodiacetic एसिड] succinyl} निकल नमक कम बहुतायत (1-10%) में (डीजीएस NTA-नी)। POPC एक संतृप्त फैटी एसिड और एक मोनो असंतृप्त वसीय अम्ल किया जाता है और यहां तक कि आरटी पर उच्च तरलता की लिपिड bilayers रूपों। डीजीएस NTA-नी पाली हिस्टिडीन पूंछ को अपने headgroup साथ बांधता है और अपनी पसंद की पाली हिस्टिडीन टैग प्रोटीन (चित्रा 1) के लिए लंगर के रूप में कार्य करता है।
"> महत्वपूर्ण बात है, माइक्रोस्कोपी हार्डवेयर उपलब्ध कराई गई जानकारी और प्रकाशिकी और लेजर भौतिकी में कुछ बुनियादी ज्ञान के साथ, किसी भी जीवविज्ञानी एक अणु इमेजिंग सेटअप का निर्माण करने में सक्षम होना चाहिए। नीचे बताए गए हैं जो बाह्य उपकरणों के एक नंबर शामिल करना चाहिए। नमूना उत्तेजना आदर्श होना चाहिए कुल आंतरिक परावर्तन (TIRF) मोड में एक औंधा माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन इस आहार इसके लिए एक विशेष TIRF सक्षम उद्देश्य (देखें नीचे)। नकली प्रकाश और सेलुलर ऑटो प्रतिदीप्ति 9 से अन्यथा परिणामस्वरूप अत्यधिक पृष्ठभूमि कम कर देता है और लेजर रोशनी की जरूरत है के रूप में। कुछ प्रयोगों मिलीसेकंड सीमा के भीतर रोशनी समय की आवश्यकता होती है और तेजी से उत्तराधिकार में संचालित होगा। रोशनी समय बचाने के लिए या इसे दो या अधिक वर्णक्रम चैनलों में उत्सर्जित प्रकाश विभाजित करने के लिए अक्सर उपयोगी है दोहराए रोशनी की वजह से अनावश्यक विरंजन से बचने के लिए। यह एक साथ readout के लिए अनुमति देता है जब conduc एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है, जो दो या दो से अधिक उत्सर्जन प्रोफाइल, कीForster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) को शामिल टिंग प्रयोगों। यहाँ एक उत्तेजना प्रकाश नाड़ी से उत्पन्न उत्सर्जन दोनों झल्लाहट दाता से दर्ज की गई और (अवगत उत्सर्जन के रूप में) स्वीकर्ता झल्लाहट जा सकता है। कैमरा रोशनी के समय के दौरान एकल fluorophores कल्पना करने के लिए पर्याप्त रूप से कम पृष्ठभूमि के साथ पर्याप्त फोटॉनों पर कब्जा करना चाहिए। कम्प्यूटर सॉफ्टवेयर उत्तेजना बंद और छवि अधिग्रहण सिंक्रनाइज़ करने के लिए कार्य करने के लिए रहना होगा। एक व्यापक सिंहावलोकन नीचे और चित्रा 2 में दिया जाता है:TIRF सक्षम उद्देश्य: उद्देश्य आधारित TIRF रोशनी के लिए उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के बराबर या मानक गिलास स्लाइड का उपयोग कर 1.4 से बड़ा होना चाहिए (एन = 1.515) 9। बढ़ाई 150x के लिए 60x के बीच हो सकती है। उद्देश्य वार्णिक अलग fluorophores जब इमेजिंग confocality के लिए अनुमति देने के लिए सही किया जाना चाहिए।
लेजर: उपलब्ध लेस की संख्याआर विकल्प काफी पिछले वर्षों में वृद्धि हुई है। आधुनिक इलेक्ट्रॉनिक रूप modulatable निरंतर तरंग लेजर डायोड लागत प्रभावी रहे हैं और अभूतपूर्व आवृत्ति और गति के साथ संचालित किया जा सकता है। अधिक महंगी गैस आयन लेज़रों लेजर बीम गुणवत्ता में उत्कृष्टता, लेकिन ठंडा बाहरी बंद (देखें नीचे) और अक्सर व्यापक (पानी) की आवश्यकता होती है।
उत्तेजना के दरवाज़े: acousto ऑप्टिकल माड्युलेटर्स (AOM) तेजी से उत्तराधिकार में 10 में तेजी से बंद अनुमति देते हैं। तंग यांत्रिक बंद के साथ एक AOM के संयोजन बंद करने के लिए सिफारिश की है। कारण निरंतर प्रकाश जोखिम को AOM का यह तरीका व्यापक हीटिंग बचा है और बंद की स्थिति में AOM से लीक प्रकाश बाहर रद्द कर दिया है।
लेंस लेजर बीम को चौड़ा करने के लिए और उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर उन्हें ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस तरह, उत्तेजना प्रकाश की TIRF रोशनी के लिए आवश्यक है, जो एक समानांतर बीम (चित्रा 3) के रूप में उद्देश्य के पत्तोंनमूना। उद्देश्य की परिधि में केंद्र से वापस फोकल हवाई जहाज़ के भीतर केन्द्र बिन्दु चल रहा किरण उद्देश्य को छोड़ देता है, जिस पर कोण बदल सकते हैं, लेकिन एक समारोह नमूना पर लेजर स्थान के स्थान (चित्रा 3) है, जो न होगा समग्र किरण ज्यामिति की। TIRF रोशनी उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ के भीतर लेजर का केन्द्र बिन्दु अनुवाद करने के लिए एक पेरिस्कोप के रूप में कार्य दर्पण का एक सेट का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है, जो एक महत्वपूर्ण कोण, पर ensues। लेंस वार्णिक सही किया जाना चाहिए और दो या तीन लेंस का एक सेट में इस्तेमाल किया जा सकता है। तीन लेंस प्रणाली उद्देश्य (चित्रा 4) के पीछे फोकल हवाई जहाज़ में चौड़ी बीम ध्यान केंद्रित करने के लिए लेजर बीम (और इसलिए नमूना पर रोशनी स्थान) और एक तिहाई लेंस को चौड़ा करने के लिए एक दूरबीन के रूप में अभिनय दो लेंस के होते हैं। दोनों कार्यों (दूरबीन और ध्यान केंद्रित) भी केवल दो लेंस के संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 4 देखें)।
<p class="Jove_content"> दर्पण लेजर प्रकाश के नुकसान से बचने के लिए कम से कम 95% चिंतनशील होना चाहिए। दो दर्पण का एक सेट आमतौर पर ऐसी व्यवस्था के रूप में लागू किया जाता है प्रत्येक बीम समायोजन के लिए ठीक एक लेजर बीम के किसी भी कोण और स्थिति को समायोजित करने के लिए पर्याप्त है।Dichroic ओवरले प्रतिबिंबित और अलग निर्दिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश संचारित और मिलाना या दो लेज़रों की कड़ियां विभाजित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
Polychroic फिल्टर dichroic फिल्टर की तुलना में अधिक जटिल हैं और आने वाली उत्तेजना प्रकाश को प्रतिबिंबित और नमूना से उत्सर्जन प्रकाश बाहर निकलने संचारित करने के लिए आवश्यक हैं। वे उद्देश्य और माइक्रोस्कोप ट्यूब लेंस के बीच फिल्टर क्यूब में रखा जाता है।
फिल्टर को साफ: लेजर नौकर डी लेजर के प्रकार पर निर्भर करता है यह लेजर के पत्तों सही होने के बाद लेजर बीम में रखा जाना चाहिए, एक संकीर्ण संचरण बैंडविड्थ के साथ फिल्टर को साफ।
पायदान फिल्टरप्रभावी रूप से एक संकीर्ण बैंडविड्थ के साथ लेजर प्रकाश को अवशोषित और सभी अन्य प्रकाश संचारित करने के लिए तैयार कर रहे हैं। वे किसी भी नकली लेजर उत्तेजना प्रकाश को फिल्टर करने के लिए उत्सर्जन पथ के भीतर रखा जाता है। हालांकि, पायदान फिल्टर 0 डिग्री भेजे गए कोण पर ही काम करते हैं। निशान फिल्टर का बैंड-चौड़ाई बहुत तेज है, तो अलग भेजे गए कोण किसी भी अधिक परिलक्षित नहीं किया जा सकता है। Collimated लेजर लेजर प्रकाश के अवरुद्ध प्रभावित नहीं है, लेकिन वापस बिखरे प्रकाश कुशलतापूर्वक कैमरा पहुंचने से रुकावट नहीं किया जा सकता है।
Ratiometric के लिए एक क्सीनन या पारा चाप दीपक के सामने रखा जब उपयुक्त फिल्टर पहियों के साथ सुसज्जित मोटर चालित फिल्टर पहियों आसानी से उत्तेजना और उत्सर्जन मार्ग में रखा गया है और अलग तरह के प्रकाश की तीव्रता (एन डी फिल्टर के साथ सुसज्जित जब) या फ्लोरोसेंट चैनल (बीच सरल स्विचिंग की अनुमति देने की जा सकती है कैल्शियम इमेजिंग या कैमरे के सामने) उत्सर्जन fluorophore के लिए चयन करने के लिए।
50:50 घन बीम फाड़नेवाला गएक दो अलग-अलग उत्तेजना किरण पथ में लेजर बीम विभाजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी पेरिस्कोप के सामने उन्हें गठबंधन करने के लिए।
बीम फाड़नेवाला (उत्सर्जन पथ): शारीरिक फिल्टर परिवर्तन के लिए किसी की जरूरत के बिना तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए, उत्सर्जन बीम एक स्थानांतरित-नीले और लाल स्थानांतरित चैनल में विभाजित है। सिद्धांत रूप में, बीम splitters एक dichroic कील या दर्पण का एक सेट और एक तरंग दैर्ध्य पर निर्भर तरीके में उत्सर्जन किरण अलग करने के लिए एक dichroic दर्पण को रोजगार से बनाया जा सकता है। दो उत्सर्जन फिल्टर उत्सर्जित चैनलों को साफ करने की जरूरत है।
स्थानिक फिल्टर: उत्तेजना बीम के स्थानिक छानने कभी कभी कम गुणवत्ता लेजर बीम से उत्सर्जित गैर समानांतर प्रकाश किरणों को दूर करने के लिए आवश्यक है। एक स्थानिक फिल्टर दोनों लेंस का केन्द्र बिन्दु पर बिल्कुल रखा एक छोटा सा पिनहोल के साथ एक दो लेंस दूरबीन के होते हैं। लेजर बीम की गैर समानांतर भागों से उत्पन्न इस तरह नकली प्रकाश कुशलता से अवरुद्ध हो जाता है। रTIRF आधारित माइक्रोस्कोपी की स्थापना जब चर्चा शर्तों को पूरा किया जाना चाहिए। केन्द्र बिन्दु में है, और पहले लेंस के छोटे फोकल लंबाई के साथ स्थिति को और अधिक मुश्किल हो जाता है, जो छोटे पिनहोल साथ स्थानिक छानने बढ़ जाती है। लेंस भटकाव की वजह से प्रभाव कम करने के लिए यह बजाय साधारण लेंस कम बढ़ाई (10x या 20x) के साथ उच्च गुणवत्ता और अनंत को सही माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के रोजगार के लिए फायदेमंद है।
पेरिस्कोप: एक पेरिस्कोप सेटअप उद्देश्य, TIRF इमेजिंग के लिए एक शर्त के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के भीतर केंद्रित लेजर बीम का अनुवाद करने के लिए आवश्यक है। यह आसानी से दो दो इंच दर्पण, पहले दर्पण और चौड़ी और माइक्रोस्कोप में उत्तेजना बीम ध्यान केंद्रित (चित्रा 5) को प्रतिबिंबित करने के लिए दूसरे दर्पण स्थिति के लिए एक के बाद एडजस्ट करने के लिए एक translational मंच से बनाया जा सकता है।
कैमरा: वापस प्रबुद्ध इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज कपल्ड डिवाइस (EMCCD) को नियमित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंएक अणु संकेतों की रिकॉर्डिंग। इस वजह से उनकी उच्च मात्रा दक्षता के उच्च अधिग्रहण की गति, (95% तक) (30 से ऊपर मेगाहर्ट्ज) और अपेक्षाकृत कम शोर है। -80 डिग्री सेल्सियस तक नीचे ठंडा थर्मल शोर कम कर देता है और वर्तमान में उपलब्ध EMCCD कैमरों के एक नंबर के द्वारा समर्थित है। EMCCD प्रौद्योगिकी की एक सीमा है कि कैमरे के शोर कैमरा लाभ दोनों के साथ रैखिक बढ़ जाती है और संकेत कब्जा किया जा रहा है। इस वजह से sCMOS चिप के विशेष स्थापत्य कला के लिए भी बहुत तेजी से EMCCD कैमरों की तुलना में काफी कम महंगे हैं और काम करते हैं, जो वैज्ञानिक CMOS (sCMOS) कैमरों के साथ ऐसा नहीं है। प्रत्येक पिक्सेल अलग संवेदनशीलता का पता लगाने की सुविधा है क्योंकि हालांकि CMOS प्रौद्योगिकी के साथ जुड़े एक समस्या यह है कि छवि अधिग्रहण अभी भी एक ही अणु के स्तर पर एक मात्रात्मक readout के कुछ डिग्री का अभाव है। प्रिंसिपल में इस पिक्सेल सामान्य बनाने के माध्यम से मुआवजा दिया जा सकता है, लेकिन इस प्रक्रिया में 11 तुच्छ से कोई मतलब है। यह है कि हम अभी भी फिर से करने में संकोच क्यों हैएक अणु माइक्रोस्कोपी के लिए sCMOS कैमरों की सराहना करता हूं, लेकिन इस प्रौद्योगिकी के तेजी से विकास के मद्देनजर, sCMOS कैमरों जल्द ही पसंद का कैमरा हो सकता है। धीरे स्कैन सीसीडी कैमरों कैमरों सब एक साथ प्रवर्धन से संबंधित शोर और पिक्सेल विचरण से बचने और वे एक तथाकथित 'गतिज' मोड में संचालित किया जा सकता है, तो सबसे तेजी से अधिग्रहण दरों समर्थन करते हैं। इस मोड ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को छोड़कर पूरे कैमरा चिप में यह संभव है एक भंडारण युक्ति के रूप में चिप ही काम करने के लिए आता है, जो छिपा हुआ है। रॉय के लिए पहली बार सामने आ रहा है के बाद, जिसके परिणामस्वरूप आरोपों छवि आगे प्रकाश जोखिम से सुरक्षित है, जहां पिक्सेल लाइन द्वारा चिप पिक्सेल लाइन का नकाबपोश क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया जाता है। नकाबपोश क्षेत्र में रॉय के सभी लाइनों के स्थानांतरण (उप millisecond रेंज में) पूरा हो जाने के बाद, रॉय खुद को अगले प्रदर्शन के लिए तैयार है। सीसीडी चिप के सभी पिक्सेल लाइनों चार्ज किया जाता है, जब तक यह चक्र दोहराया है। चिप तो स्पष्ट रूप से Redu के साथ धीरे-धीरे बाहर पढ़ने के लिए हैCED readout शोर। एक 1000 x 1300 पिक्सेल चिप पर उदाहरण के लिए, 50×50 पिक्सेल के 20 ROIs तेजी से उत्तराधिकार में दर्ज किया जा सकता है। छवियों बाहर पढ़ने के लिए जा रहा से पहले एक काफी समय के लिए चिप पर बने हुए हैं, क्योंकि यह अत्यधिक थर्मल शोर को कम करने के लिए एक साधन के रूप में (तरल नाइट्रोजन के साथ उदाहरण के लिए) के लिए उच्च गुणवत्ता मास्किंग सुनिश्चित करने के लिए और कैमरा शांत करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ EMCCD कैमरों भी गतिज मोड समर्थन करते हैं।
सॉफ्टवेयर: लेजर, दरवाज़े, AOMS और कैमरा जोखिम के समय के रूप में अच्छी तरह से उचित छवि भंडारण किसी भी सफल इमेजिंग प्रयोग का अभिन्न अंग हैं। प्रिंसिपल कई परिभाषित संचालन कैमरा के साथ आते हैं कि उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल के साथ प्रोग्राम किया जा सकता है। वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर संकुल थोड़ा तकनीकी जानकारी के साथ लागू किया जा सकता है, जो हार्डवेयर peripherals की एक बड़ी संख्या को समर्थन करते हैं।
पल्स जनरेटर, डाटा अधिग्रहण (DAQ) (एनालॉग और डिजिटल उत्पादन चैनलों के साथ) बोर्ड और आस्टसीलस्कप: एक पल्स जनरेटर है एकउत्कृष्ट पसंद निर्धारित समय और वोल्टेज की दालों में ट्रिगर दालों बदलने के लिए। इस तरह लेज़रों ठीक बिजली उत्पादन के लिए नियंत्रित और उप millisecond रेंज को मिलीसेकंड में समय पर किया जा सकता है। एनालॉग आउटपुट के साथ DAQ बोर्डों उसी को प्राप्त है और आसानी से पीसीआई स्लॉट के माध्यम से कंप्यूटर के मदरबोर्ड में एकीकृत कर रहे हैं। पल्स अवधि, आयाम और आवृत्ति एक आस्टसीलस्कप के साथ सत्यापित कर रहे हैं।
पूरे उत्तेजना किरण पथ के बाड़े: कारण पूरे उत्तेजना किरण पथ अपनी प्रयोगशाला वातावरण से संलग्न किया जाना चाहिए हवा convections को उत्तेजना प्रोफ़ाइल में उतार-चढ़ाव से बचने के लिए। TIRF माइक्रोस्कोपी का आयोजन करते हैं तो यह उपाय विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। ऑप्टिकल घटकों को भी धूल और लेजर प्रकाश जोखिम से मानव आँख से सुरक्षित हैं। बाड़ों आसानी से कला की आपूर्ति भंडार में खरीदा जा सकता है, जो काले कार्ड बोर्ड से निर्माण किया जा सकता है।
Photobleac बाद SLB प्रतिदीप्ति वसूली की तरलता निर्धारित करने के लिएहिंग (FRAP) के मापन के 12 प्रदर्शन कर रहे हैं। FRAP के लिए दो उत्तेजना किरण पथ का अस्तित्व (चित्रा 3 देखें) की सलाह दी जाती है। पहली किरण पथ छवि के लिए bilayer के प्रतिदीप्ति बनाया गया है। इस TIRF विन्यास में और कम प्रकाश की तीव्रता के साथ किया जा सकता है। यह ऑप्टिकल अक्ष के साथ उद्देश्य छोड़ देता है, ताकि दूसरे किरण पथ, एक छोटी लेकिन तीव्र ब्लीच नाड़ी के लिए अनुमति चाहिए और गैर-TIRF मोड में विन्यस्त किया जाना चाहिए। एक दौर एपर्चर उत्तेजना किरण पथ में रखा जा सकता है परिभाषित किनारों के साथ एक पूरी तरह गोल ब्लीच प्रोफ़ाइल परियोजना के लिए (8 चित्रा देखें)। छवि के लिए आदेश में वस्तु विमान पर इस एपर्चर, अपने इष्टतम स्थिति (चित्रा 3 देखें) लेंस 3 के फोकल हवाई जहाज़ में किया जाएगा। एपर्चर थोड़ा स्थानांतरित कर दिया पदों पर रखा गया है हालांकि, जब इस वजह से यह लेंस की लंबी फोकल लंबाई करने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता का एक एपर्चर छवि भी उत्पन्न हो सकता है।
प्रदर्शन टी होने के बादवह कच्चे डेटा उचित रूप से विश्लेषण किया जाना चाहिए प्रयोग इमेजिंग। कई कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्राप्त करने और डेटा का विश्लेषण करने, मुख्य सेटिंग्स (जैसे रोशनी शक्ति और समय, TIRF कोण) के समायोजन को कवर किया है, जो पेशकश कर रहे हैं।
एक अणु माइक्रोस्कोपी उनके पैतृक सेलुलर पर्यावरण के भीतर प्रोटीन के व्यवहार का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। आण्विक इमेजिंग एक व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए इसलिए तेजी से आकर्षक हो जाता है, फिर भी कई जीवन वैज्ञानिकों को अब भी दूर प्रौद्योगिकी और विशेषज्ञता में प्रारंभिक निवेश से दूर भागते हैं। एक के अपने इमेजिंग प्रणाली कोडांतरण से उत्पन्न होने वाली मुख्य लाभ यह है कि आसानी से किसी के भी विशिष्ट जरूरत को समायोजित किया जा सकता है।
इस के साथ साथ सुझाव के रूप में एक गैर TIRF उत्तेजना बीम आसानी से एक मौजूदा TIRF प्रकाश पथ के अलावा लागू किया जा सकता है, fluorophores और ligands के तेजी से और परिभाषित तस्वीर विरंजन (या -activation) वांछित है, जैसे जब प्रदर्शन FRAP या ligand uncaging के प्रयोगों 14 । एक उत्सर्जन बीम फाड़नेवाला की शुरूआत के कम से कम दो के साथ रिकॉर्डिंग के लिए और चार फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए कुछ मामलों में अनुमति देता है। एक्सटेंशन की सूची केवल द्वारा सीमित सार में हैएक की अपनी कल्पना।
उदाहरण के लिए, उत्सर्जन रास्ते में एक मोटर चालित उत्सर्जन फिल्टर पहिया लागू करने अप करने के लिए दस अलग फ्लोरोसेंट चैनलों के बीच तेजी से बदलने के लिए अनुमति देता है। दो मोटर उत्सर्जन फिल्टर पहियों के संयोजन जब 18 फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए बाहर पढ़ा जा सकता है, इस श्रृंखला में (प्रत्येक 10 फिल्टर स्लॉट के साथ सुसज्जित)। TIRF इमेजिंग आधारित कैल्शियम लामबंदी माप और एक क्सीनन या बुध उत्तेजना दीपक पथ के एकीकरण के बाद हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) के साथ पूरक हो सकते हैं। आईआरएम कोशिकाओं कांच की सतह या एक SLB से जुड़े होते हैं और TIRF आधारित इमेजिंग डेटा की व्याख्या जब इसलिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं जो करने के लिए डिग्री कल्पना करने के लिए पसंद की विधि है। एक साधारण dichroic दर्पण के उपयोग और photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) या स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) का आयोजन अनुमति देता है एनएम 405 का एक अतिरिक्त लेजर, यानी दो superresolut साथ एक चौड़ी उत्तेजना बीम की स्थापनादृश्य प्रकाश 15,16 के विवर्तन सीमा से नीचे एक स्थितीय सटीकता के साथ आयन के तरीके।
हालांकि, प्रयोगात्मक सफलता न केवल उचित हार्डवेयर का एक मामला है। शोर कम TIRF आधारित इमेजिंग का पूरा फायदा उठाने के लिए, कोशिकाओं कोशिका की सतह पर बाधाओं लागू या कि उनकी प्लाज्मा झिल्ली के शरीर क्रिया विज्ञान के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि एक फैशन में एक सतह के लिए संपर्क करना चाहिए। SLBs सभी SLB-एम्बेडेड ligands के पहलू के बल मोबाइल हैं और बाध्यकारी और अलगाव की गतिशीलता रिसेप्टर के जवाब में bilayer के भीतर अपने पार्श्व स्थिति को समायोजित क्योंकि कोशिका आसंजन के लिए उचित प्रोटीन इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से अनुकूल अधिक कर रहे हैं के साथ क्रियाशील।
एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन में SLBs का निर्माण करने के लिए, यह उच्च शुद्धता की एसयूवी के साथ बाहर शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है। इस के साथ साथ वर्णित है, यह इन मैं के रूप में दो ultracentrifugation के चरणों में भी sonication के दौरान उत्पादन किया जाता है, जो multilamellar पुटिकाओं, दूर करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण हैउच्च तरलता की विशेषता सन्निहित SLBs के गठन के साथ nterfere। केवल साफ कांच सतहों पर उच्च गुणवत्ता वाले फार्म की SLBs। एक बार साफ गिलास स्लाइड तुरंत इस्तेमाल किया या शून्य में संग्रहित किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात है, SLBs उनके विघटन करने के लिए नेतृत्व करेंगे इस के रूप में हवा के संपर्क में किया जा कभी नहीं करना चाहिए। SLB धोने यह एक बचा है लेकिन यह भी समय की बचत प्रक्रिया ही नहीं है, के रूप में बफर एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के उपयोग के साथ rinsing, के रूप में दिखाया, शामिल है।
SLB-निवासी प्रोटीन की कटाई और शुद्धि के दौरान डिटर्जेंट के उपयोग से बचना चाहिए। इस डिटर्जेंट भी जब वर्तमान मात्रा का पता लगाने में काफी प्रोटीन गतिशीलता कम हो जाएगा क्योंकि है। सब एक साथ डिटर्जेंट के लिए की जरूरत को नाकाम करने के लिए, स्रावित polyhistidine टैग सुसज्जित ligands के घुलनशील अभिव्यक्ति स्तनधारी या कीट कोशिकाओं में सिफारिश की है। कोलाई समावेश शरीर से refolding की आवश्यकता है, सावधानी उनकी संयुक्त राष्ट्र और refolding करने से पहले समावेश शरीर से प्रभावी ढंग से डिटर्जेंट दूर करने के लिए लागू किया जाना चाहिए।
विशेष सेल सक्रियण और कोशिका आसंजन के लिए एक दिया रिसेप्टर ligand बातचीत की भूमिका काटना करने के लिए अनुमति देता है जो उनके मॉड्यूलर और reconstitutive प्रकृति से SLBs परिणाम रोजगार का एक बड़ा फायदा। इस संबंध में यह डीजीएस NTA-नी NTA-एनआई बाध्यकारी साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा प्रोटीन को रोकने के क्रम में SLB के भीतर 10% पर मौजूद होना चाहिए कि उल्लेख करना महत्वपूर्ण है। केवल 1% या 2% डीजीएस NTA-नी, एक दिया polyhistidine टैग प्रोटीन प्रजातियों के सहयोग में कमी को शरण देने SLBs रोजगार जब अप्रकाशित (विशेष रूप से एक दूसरे polyhistidine टैग प्रोटीन प्रजातियों की बढ़ती मात्रा के सह-incubating जब देखा जा सकता है अवलोकन)। 10% डीजीएस NTA-नी विशेषता SLBs के साथ काम करते हैं तो यह घटना नहीं मनाया जाता है।
हम महानिदेशकों NTA-नी युक्त SLBs करने के लिए परीक्षण किसी भी polyhistidine टैग प्रोटीन के बंधन गैर विशिष्ट कभी नहीं देखा है, जबकि पहली बार के लिए एक प्रोटीन को शुरू करते हैं, तो इस संभावना परीक्षण किया जाना चाहिए,यह अंत करने के लिए हम महानिदेशकों NTA-नी (प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं होना चाहिए) से रहित SLBs के इस्तेमाल की सिफारिश। डीजीएस NTA-नी युक्त एक SLB का उपयोग करते समय दूसरे, प्रोटीन पीबीएस 300 मिमी imidazole युक्त साथ SLB धोने के बाद पूरी तरह से बंद आना चाहिए।
SLBs रोजगार का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ क्षणिक बातचीत और संकेत घटनाओं बढ़ाया spatiotemporal संकल्प 17-19 से नजर रखी जा सकती है। एक तीन आयामी बाध्यकारी प्रक्रिया अनिवार्य रूप से विशेष रूप से शोर-तनु TIRF मोड में जब रिकॉर्डिंग, दो इमेजिंग आयाम के लिए कम है क्योंकि इस हिस्से में कम से कम है। SLBs के उपयोग के एक अणु संकेत का पता लगाने, फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) या स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के लिए एक शर्त है, विवर्तन सीमा 15,16 के नीचे एक संकल्प के साथ यानी superresolution माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है। इन विशेष रूपरेखा इमेजिंग एक अणु Forster अनुनाद ऊर्जा ट्रा सक्षमnsfer प्रयोगों एक synaptic वातावरण 20 में अलग-अलग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत कल्पना करने के लिए बनाया गया है। यह दृष्टिकोण "मापने TCR-pMHC एक झल्लाहट आधारित माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग बाध्यकारी" 21 करार दिया एक जौव प्रकाशन में काफी विस्तार से समझाया गया है।
SLB आधारित प्रयोगों की व्याख्या करते समय एक हमेशा एक जीवित कोशिका का एक प्लाज्मा झिल्ली के सभी गुण SLBs द्वारा चित्रित कर रहे हैं कि दिमाग में रखना चाहिए, और लापता गुणों में से कुछ को जांच के तहत शरीर विज्ञान को प्रभावित कर सकता है। सब के बाद, SLB-एम्बेडेड प्रोटीन स्वतंत्र रूप से diffusing और उनके सेलुलर समकक्षों के सबसे 5,6,22 के रूप में झिल्ली microdomains में संगठित नहीं हैं। कुछ हद तक जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली वास्तुकला के संरक्षण के जो पक्षपाती कोशिकाओं से प्राप्त स्थिर प्लाज्मा झिल्ली चादरें, सफलतापूर्वक बी लिम्फोसाइटों 23 से झिल्ली एम्बेडेड एंटीजन से तेज अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, यहां तक कि इस तरह केझिल्ली एक अत्यंत गतिशील cytoskeleton के साथ बातचीत और वे एक कठोर कांच की सतह से समर्थन कर रहे हैं के रूप में कोई लचीलापन सुविधा नहीं है। इन विसंगतियों को ध्यान में रखते समायोज्य लचीलापन की सतहों से या स्थानीय रूप से लागू प्रकाश दालों के जवाब में उनकी कठोरता बदलने जो सतहों द्वारा समर्थन कर रहे हैं एक परिभाषित फैशन में प्रोटीन compartmentalize का मतलब है और जो जो इंजीनियरिंग SLBs, के लिए एक की जरूरत स्पष्ट रूप से नहीं है।
The authors have nothing to disclose.
एमए वित्तीय और प्रशासनिक सहायता के लिए ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF, J3086-B11) और धन्यवाद का एक Schrödinger फैलोशिप मैक्स प्लैंक-सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया। जीएस वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF, LS13-030) द्वारा समर्थित किया गया। झा वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF, LS14-031) द्वारा समर्थित किया गया।
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |