Utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

Simon W. Fellgett; Simon A. Ramsbottom; Richard J. Maguire; Stephen Cross; Peter O'Toole; Mary E. Pownall

doi:10.3791/53162

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Article de méthode

Utilisation de l'analyse confocale

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DOI :

10.3791/53162

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14 décembre 2015

Simon W. Fellgett¹ , Simon A. Ramsbottom² , Richard J. Maguire³ , Stephen Cross⁴ , Peter O'Toole⁵ , Mary E. Pownall⁵

¹Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, ²Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, ³Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, ⁴School of Biochemistry, University of Bristol, ⁵Biology Department, University of York

Dans cet article

Résumé

Le manuscrit ici fournit un jeu simple de méthodes pour analyser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par fluorescence dans Xenopus. Ceci permet d'obtenir un contexte pour tester la capacité des autres protéines de modifier la distribution de ligand et en permettant des expériences qui peuvent donner un aperçu des mécanismes de régulation des gradients de morphogènes.

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour visualiser des ligands distribués à travers un champ de cellules. La facilité de l'expression de protéines exogènes, ainsi que la taille de leurs cellules dans des embryons précoces, faire Xenopus laevis un modèle utile pour visualiser des ligands GFP étiqueté. ARNm synthétiques sont efficacement convertis après l'injection dans des embryons de xénope à un stade précoce, et les injections peuvent être ciblés pour une seule cellule. Lorsqu'il est combiné avec un traceur de lignage comme membrane attaché DP, la cellule injectée (et ses descendants) qui sont la production de la protéine surexprimée peuvent facilement être suivies. Ce protocole décrit un procédé pour la production de fluorescence étiquetée Wnt et Shh ligands injecté à partir de l'ARNm. Les procédés impliquent la micro dissection des explants ectodermiques (caps animales) et l'analyse de la diffusion de ligand dans plusieurs échantillons. En utilisant l'imagerie confocale, informations sur la sécrétion ligand et la diffusion sur un champ de cellules peut être obtenue. Les analyses statistiques des images confocales fournissent des données quantitatives sur la forme de gradients de ligands. Ces méthodes peuvent être utiles aux chercheurs qui veulent tester les effets des facteurs qui peuvent réglementer la forme de gradients de morphogènes.

Introduction

Au cours du développement embryonnaire précoce, les cellules sont progressivement engagés à suivre lignées spécifiques de différenciation: cela signifie un groupe de totipotentes (ou pluripotentes) cellules deviennent progressivement limité à établir des populations de cellules progénitrices déterminées pour donner naissance à un type de cellule. Signalisation cellule-cellule est au cœur de la régulation de la spécification de la lignée cours du développement embryonnaire. La manipulation de ces signaux sera nécessaire pour diriger les cellules souches vers destins particuliers pour soutenir nouveaux traitements médicaux.

Un nombre relati....